运动性横纹肌溶解高反应者ACE/CK-MM基因多态性分析

目的探讨中国汉族运动性横纹肌溶解(ERB)高反应者(HR)ACE基因I/D多态性及肌酸肌酶(CK)-MM基因限制性酶切片段多态性的分布特点。方法采用PCR及限制性酶切多态性分析技术,对12例中国汉族ERB HR的ACE、CK-MM基因多态性进行检测、分析。结果本组12例ERB HR的ACE基因频率I为54%、D为46%,D等位基因频率较汉族正常人群高,但无统计学意义(P=0.146);汉族正常人群与高加索正常人群相比,P<0.01。本组ERB HR的CK-MM基因频率A为71%、G为29%,G等位基因频率较汉族正常人群高,但无统计学意义(P=0.078);汉族正常人群与高索ERB HR的该基因频率高度一致(P=0.992)。结论汉族ERB HR人群ACED、CK-MMG等位基因频率均稍高于汉族正常人群。

MALT1-A20-NF-κB信号分子在MM中的表达特点

目的:了解多发性骨髓瘤(MM)患者外周血中黏膜相关组织淋巴瘤异位基因1(MALT1)、A20与核转录因子κB(NF-κB)基因的表达特点。方法:采用SYBR GreenⅠ荧光实时定量PCR和相对定量分析法检测20例MM患者(Ⅰ期7例,Ⅱ期3例,Ⅲ期10例)及21例健康人外周血单个核细胞(PBMC)中MALT1、A20和NF-κB基因的表达情况。以β2微球蛋白基因(β2m)作为内参;采用相对定量公式:α^(-△Ct)×100%,分别计算MALT1、A20和NF-κB基因的表达水平。结果:MM患者PBMC中的MALT1和A20基因的表达水平较健康人都有明显的降低(P=0.000),而MM中NF-κB基因的表达水平较正常人有所升高,但无统计学差异(P>0.05)。在健康人组,MALT1和NF-κB的表达水平呈现正相关(P=0.001,r=0.666),而在MM组,MALT1、A20与NF-κB 3种基因均不存在明显相关性。同时,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期MM患者MALT1基因的表达量较健康人明显降低(P<0.05),A20基因的表达量较健康人明显降低(P<0.01),而Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期MM患者MALT1、A20和NF-κB之间的表达情况均无统计学差异。结论:当MALT1-A20介导的细胞免疫和炎症的信号通路发生异常改变时,可能与MM的发生发展有着密切关系。

犬贾第虫MM/Sac-C/1基因的克隆及序列分析

利用PCR技术从犬贾第虫滋养中扩增出了2004bp大小的MM/Sac-C/1基因,构建了p MD-MM/Sac-C/1克隆载体,并进行了序列测定,利用计算机对该序列进行了核苷酸同源性比较.结果表明,与GeneBank登陆的蓝氏贾第虫WB株AF236019序列比较,其同源性为98%,蛋白质同源性比较结果显示,与蓝氏贾第虫WB株表面抗原的同源性为90%,获得了犬贾第虫MM/Sac-C/1基因.

慢病毒介导shRNA干扰ADAM10基因对多发性骨髓瘤MM.1S细胞增殖作用的研究

目的:探讨干扰ADAM10基因对多发性骨髓瘤MM.1S细胞增殖与凋亡的影响及其作用机制。方法:设计4对针对ADAM10 mRNA不同位点的shRNA编码序列,分别连接到慢病毒载体质粒p LVshRNA-EGFP(2A)Puro中去,构建sh/ADAM10-1,sh/ADAM10-2,sh/ADAM10-3,sh/ADAM10-4和sh/Con;将重组质粒与慢病毒包装质粒及包膜质粒共转染293FT细胞,收获病毒颗粒,浓缩后测定病毒滴度,感染MM.1S细胞,流式细胞术分选GFP+细胞。利用实时定量PCR及Westem blot检测慢病毒载体介导的shRNA干扰ADAM10基因的作用。选取ADAM10下调最显著的细胞株,CCK-8法检测干扰ADAM10后细胞的增殖,Annexin V/7-AAD双染流式细胞术检测细胞存活与凋亡,定量PCR检测促凋亡基因BAD、BAK、BIK抑凋亡基因BCL-2、c-Myc以及Notch1及其下游靶基因Hes-1的转录变化。结果:成功构建了特异性干扰ADAM10表达的慢病毒载体,干扰ADAM10基因对MM.1S细胞的增殖具有抑制作用,并能诱导MM.1S细胞的凋亡,且促凋亡基因BAD、BAK表达升高,抑凋亡基因BCL-2、c-Myc表达降低。Q-PCR结果显示,干扰ADAM10后Notch1水平升高,Hes-1水平降低。结论:干扰ADAM10基因可显著抑制MM.1S细胞的增殖,促进其凋亡,其机制与Notch1信号通路有关。

多发性骨髓瘤驱动基因的筛选

目的:鉴定并比较不同测序方案中多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)潜在的驱动基因,为探讨MM的发生机制提供研究基础。方法:选择两套数据,一套数据为2016年5月至2020年11月苏州大学附属第二医院84例MM患者的基因组靶向突变测序数据,另一套数据从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库下载的205例MM全基因组测序数据。在R4.1.0环境下,利用驱动基因识别算法对MM的潜在驱动基因进行挖掘,分析并比较两套数据筛选出的驱动基因及具体突变信息。结果:NRAS、KRAS、TP53、IDH1为两套数据共同识别出的驱动基因。两套数据中突变基因在NOTCH、RTK-RAS、Cell-Cycle、TP53、MYC及WNT通路均有富集。显著突变的NRAS、KRAS、TP53和IDH1在两套数据中发生突变的位点无显著性差异。另外,通过靶向突变测序方法,鉴定出MM新的驱动基因,CBL、BCOR和DNMT3A。结论:通过本研究获得了MM可能的驱动基因,有助于从基因分子层面揭示MM发生发展机制。

Mm.158494基因在白消安引起的无精子症小鼠中的表达

目的建立一个小鼠无精子症模型,并探讨Mm.158494基因在无精子症中的表达及意义。方法建立无精子症小鼠模型,观察小鼠睾丸生精小管结构的变化。筛选与精子发生相关的睾丸特异性新基因,利用网络信息资源对该基因进行生物学信息分析,RT-PCR分析该基因在无精子症小鼠睾丸中的表达。结果生物信息学分析发现Mm.158494基因cDNA序列全长1046bp,含有762bp的完整开放阅读框。编码253个氨基酸、分子量为29.432kDa的蛋白质。小鼠无精子症模型中微弱表达Mm.158494基因。结论Mm.158494基因在无精子症中表达明显降低,提示该基因可能在精子发生中起重要作用。

婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌双重荧光PCR快速检测方法的建立

旨在建立针对阪崎肠杆菌的双重荧光PCR快速检测方法。以阪崎肠杆菌局部大分子合成(MMS)操纵子和外膜蛋白A(ompA)为靶基因,建立双重荧光 PCR 反应体系,探讨该体系的特异性、灵敏度和抗干扰能力。结果表明,双重荧光 PCR 体系对阪崎肠杆菌的灵敏度为4.3×10~3CFU/mL,人工污染初始菌量为2 CFU/100 g奶粉样品增菌24 h即可检出;39株实验菌中的15株阪崎肠杆菌出现特异性扩增,24株非阪崎肠杆菌未出现特异性扩增。本研究所建立的双重荧光PCR体系特异好、灵敏度较高及抗干扰能力强,可用于婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌的快速检测。

多发性骨髓瘤患者免疫球蛋白重链基因重排的检测及意义

目的 探讨免疫球蛋白重链 (IgH)基因重排在多发性骨髓瘤 (MM)诊治中的应用。方法 采用半巢式PCR技术 ,分别用MM患者的IgH基因的CDR2和CDR3区的两组引物 ,对 6 1份MM患者的骨髓和外周血单个核细胞进行扩增。结果 2 7份骨髓标本中 ,IgH基因重排Fr2A阳性率为 70 .4 % (19/ 2 7) ,34份外周血标本阳性率 5 8.8% (2 0 / 34)。骨髓标本的Fr2A阳性率略高于外周血标本 ,而Fr3A的阳性率两者无明显差异。MM患者的IgH基因重排与Ig型别、临床分期及浆细胞数有关。IgG型IgH基因重排阳性率高于IgA型及轻链型 ;III期患者IgH基因重排阳性率高于I、II期患者 ;浆细胞数大于 5 %时 ,IgH基因重排阳性率略高 ;7例达临床完全缓解的患者中 ,仅有 1例IgH基因重排Fr2A、Fr3A均转为阴性。结论 PCR技术检测MM患者IgH基因重排可作为诊断、疗效观察、预后判断及微小残留病监测的参考指标之一。

甲基磺酸甲酯诱发WTK1细胞tk位点突变试验方法的建立

目的 :建立WTK1细胞tk基因突变试验方法 ,为毒理学评价和机制的研究提供实验依据。 方法 :用标准诱变剂甲基磺酸甲酯(MMS)处理WTK1细胞 ,检测tk位点突变率和细胞 p53基因蛋白表达水平的改变。 结果 :MMS可诱导WTK1细胞tk位点突变率增加 ,MMS的处理剂量达到10mg·L-1 时 ,tk位点突变率为985.2/106 个细胞 ,并有剂量反应关系。诱发突变率约是自发突变率3～10倍。在tk位点诱发了两种不同表型的突变集落 ,即正常生长突变体(tk_NGmutant)和慢生长突变体(tk_SGmutant) ,但以慢生长突变体为主。MMS处理后 ,WTK1细胞P53蛋白的表达水平增高。 结论 :MMS可以诱发WTK1细胞tk位点的突变率增加 ,MMS处理细胞后 ,P53蛋白的表达水平增高 ,说明WTK1细胞的P53蛋白的功能尚未丧失。该方法的建立 ,为进一步开展tk基因突变试验 。

多发性骨髓瘤患者13q14.3区域一个候选抑瘤基因MYETS1的克隆与序列分析(英文)

为克隆位于多发性骨髓瘤(multiplemyeloma,MM)患者染色体13q14.2～13q21.1区域候选抑瘤基因,通过生物信息学分析获取疾病基因定位区域内代表新基因的ESTs,并运用半定量RT-PCR检测它们在正常人与MM患者骨髓组织中的表达水平,发现一条在MM患者骨髓组织中明显表达下调的EST(GenBank收录号:H86826).Northern印迹杂交显示H86826在骨髓组织中转录本大小为1.5kb.通过购买商品化克隆IM-AGE223589测序获得了H86826所代表的基因的1491bp全长cDNA序列(GenBank收录号:AY368652),人类基因组命名委员会将其命名为MYETS1(myelomatumorsuppressor1).生物信息学分析其为一个编码分子质量为15.1kD、等电点为6.13的135个氨基酸的新基因.该基因的功能正在进一步的研究之中.

轻度修饰低密度脂蛋白诱导内皮细胞基因差异表达的研究

目的 :研究在轻度修饰低密度脂蛋白 (mm LDL)诱导下差异表达的基因 ,探讨动脉粥样硬化发生的分子机制。方法 :用DDRT PCR(differential displayreversetranscription PCR)技术分析mm LDL诱导下人血管内皮细胞的基因表达差异 ,并用反向Northern证实差异显示基因。结果 :mm LDL诱导下人血管内皮细胞出现一些上调和下调的基因 ,上调基因有胸腺素β4、FGFRI原癌基因伴随蛋白、FK5 0 6结合蛋白、rTSβ蛋白和细胞间粘附分子 1 ;下调基因有Apobec 1结合蛋白 1、细胞色素B5 61和ERP72。结论 :体外mm LDL可诱导HUVEC细胞一些基因表达水平变化 。

IgH基因重排对骨髓瘤患者监测的临床意义

目的:探讨免疫球蛋白重链(IgH)基因重排在多发性骨髓瘤(MM)患者治疗过程中监测的临床意义。方法:回顾分析41例经治疗后达到非常好的部分缓解(VGPR)或以上疗效的MM患者外周血的PCR的结果,包括自体外周血干细胞移植(ASCT)患者21例和未移植患者20例。观察患者确诊时的IgH阳性率、达到上述疗效时的转阴率,以及两组患者的复发率和持续缓解时间(DOR)的差异。结果:41例患者IgH克隆性重排阳性35例(85.4%),经化疗后达疗效时IgH转阴率为25.6%。移植组未转阴者复发率为7/12,DOR为22.5个月,转阴者复发率为1/5,DOR为42.5个月。未移植组未转阴者复发率为7/13,DOR为22个月,转阴者复发率为1/5,DOR为21个月。结论:PCR技术检测MM患者IgH基因重排可作为诊断、疗效观察、预后判断及微小残留病灶监测的参考指标之一。

肝癌缺失基因1(DLC-1)甲基化在多发性骨髓瘤患者中的临床意义

目的探讨肝癌缺失基因1(DLC-1)启动子区CpG岛甲基化在多发性骨髓瘤(MM)患者中的表达及相关临床意义。方法采用重亚硫酸盐测序PCR(BSP)法定量检测自2016年10月—2017年12月在新疆医科大学附属肿瘤医院初诊的30例MM患者DLC-1基因的甲基化状态,分别进行MM患者的临床资料分析、MM患者及健康对照组关于DLC-1基因甲基化情况的比较,以及MM患者DLC-1基因甲基化情况与相关临床指标的比较。结果(1)临床资料有关M蛋白的免疫分型提示:30例MM患者中IgG型21例(21/30),IgA型6例(6/30),轻链型3例(3/30);骨髓细胞学检查提示:MM患者中骨髓瘤细胞比例<30%的有6例(21/30),30%~50%之间的有19例(19/30),≥50%的有5例(5/30)。(2)MM组与对照组比较提示:MM组DLC-1启动子区甲基化率显著高于正常组(P=0.009),其中CpG岛4、6、7、13、21位点的甲基化率显著高于正常对照组(P值分别为0.017、0.030、0.023、0.017、0.044)。(3)进一步对MM患者深入比较发现,DLC-1基因的甲基化比例分别在Ⅱa+Ⅲa期与Ⅲb期组间、血清肌酐正常与升高患者组间、骨髓异常浆细胞/骨髓瘤细胞比例50%≥与<50%组间均存在统计学差异(P均<0.05)。结论DLC-1异常甲基化可能与肿瘤负荷及肾功能损害相关,深入研究有关DLC-1基因甲基化在MM患者中的表达情况,可为今后MM的去甲基化治疗提供新的研究思路。

DNA甲基化与多发性骨髓瘤

DNA甲基化是目前肿瘤领域研究中研究最多的表观遗传学机制之一.主要发生在DNA的CpG岛.DNA的甲基化通过甲基转移酶(DNA methyltransfeases,DNMTs)完成.DNA甲基化在多种肿瘤的发生、发展中都起到了重要的作用.大量研究发现,甲基化与多发性骨髓瘤的发生、发展及诊断治疗等有密切关系.深入探讨多发性骨髓瘤(MM)相关的甲基化可为MM发病机制的研究及治疗提供新的思路.

基于芯片数据库Oncomine分析CTGF基因在多发性骨髓瘤中的表达和临床意义

目的研究结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)基因在多发性骨髓瘤(multiplemyeloma,MM)及正常组织中的表达和临床意义。方法检索Oncomine数据库中所有关于CTGF的数据集,对其在MM中的作用进行Meta分析。结果Oncomine数据库中共收集了456项不同肿瘤中关于CTGF的研究,与正常组织相比,其表达差异具有统计学意义的共52项,其中CTGF表达增高28项,表达降低24项。共4项研究中的8个数据集包含379例样本涉及CTGF在MM组织与正常组织中的表达,与正常组织相比,5个数据集中CTGF在癌组织中呈显著高表达(P<0.05),2个数据集中其表达差异无统计学意义(P>0.05),1个数据集中其统计值P=1.000。Meta分析结果显示,CTGF在癌组织与正常组织中的表达差异无统计学意义(P>0.05);进一步分析发现,GTGF表达量与预后无显著关联性(P>0.05)。结论CTGF在正常组织和MM组织中表达无明显差异,不能作为MM的一个潜在的标志物,不能对预后进行预测。

基因表达谱技术在多发性骨髓瘤分子分型中的应用

多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一种具有高度异质性的恶性浆细胞疾病。在过去的几年里,随着新药的出现患者的生存已得到极大的改善,但在分子分型及预后评估方面仍面临挑战。以基因表达谱(gene expression profiling,GEP)技术为基础的转录组学研究在很大程度上有助于破译MM的复杂性,为MM的分子分型提供新的视角。基因表达谱芯片可以检测编码和非编码基因的表达、突变和新的转录组修饰,提供更多不同骨髓瘤亚群治疗和预后的新信息。目前,已在多项临床试验中发现基因表达谱可以作为独立的预后因素评估不同队列患者的预后。尽管目前临床上尚未将基因表达谱整合到骨髓瘤的诊断和治疗中,但多个研究中心已开展针对骨髓瘤的表达谱数据研究。通过对公共数据库表达谱数据进行聚类分析,建立临床预后模型,在疾病的动态演变中识别高风险和低风险患者,预测治疗敏感性,找寻新的治疗靶点,使得从转录组水平上制定个体化治疗成为可能。本文就基因表达谱技术在骨髓瘤分子分型中的应用展开综述。

结合基因表达谱探讨恶性黑色素瘤免疫微环境分型的预后预测价值

目的:探讨恶性黑色素瘤(malignant melanoma,MM)微环境分型对MM患者预后的评估价值。方法:对2010年7月至2017年5月在南京鼓楼医院手术切除的87例原发性MM组织进行二代测序,免疫组化法检测PD-1、PD-L1、CD3^(+)TIL、MSH2、MSH6、PMS2和MLH1的表达。随访患者的生存时间,分析不同免疫微环境分型对患者预后的影响及其基因表达特征。结果:根据PD-L1和TIL表达水平将87例MM患者的肿瘤微环境分为4个亚型:PD-L1^(+)TIL^(+)型或双阳型(15/87,17.24%)、PD-L1^(+)TIL^(-)型(15/87,17.24%)、PD-L1-TIL^(+)型(20/87,22.99%)、PD-L1-TIL^(-)型或双阴型(37/87,42.53%)。双阳型患者的中位无病生存期显著长于双阴型患者(P<0.05),此可能与双阴型患者存在更多CDK4、MCL1、MYC、AKT2、CCDD1、FGF19等预后不良基因拷贝数扩增相关;双阳型患者PD-1表达显著高于双阴型患者(P<0.01),可能与PD-L1、TIL分别与PD-1呈共表达和共不表达有关。结论:根据PD-L1及TIL表达将MM患者微环境分为4种亚型,能够区分MM患者预后,双阴型患者存在更多预后不良基因拷贝数扩增。

基因DCAF8在多发性骨髓瘤中的临床意义

目的:寻找多发性骨髓瘤(MM)基因芯片数据集中的潜在致病基因、疾病诊断和预后相关因子并阐明其作用机制。方法:获取基因芯片数据集GSE13591和Zhan Myeloma,使用R语言进行基因差异表达分析。对共同高表达基因进行Meta分析,得到P值中位秩次TOP10基因。CCLE数据库分析TOP10基因在各肿瘤细胞系中的mRNA表达情况,筛选出蛋白酶体通路相关基因8(DCAF8)。cBioPortal数据库中分析DCAF8基因在各肿瘤细胞系的突变率。WB检测DCAF8蛋白在骨髓瘤细胞系中的表达情况。SPSS和Graph Pad软件分析DCAF8表达量和MM患者临床特征之间的相关性,进行受试者工作特征曲线(ROC曲线)绘制和生存分析。R语言Custer Profiler Package和Metascape数据库对DCAF8互作蛋白基因和共表达基因进行GO和KEGG功能富集分析。结果:数据集GSE13591和Zhan Myeloma的上调基因取交集得到477个共同高表达基因。在合并数据集中对上述基因进行Meta分析,得到P值中位秩次TOP10基因,DCAF8在MM细胞系中的平均表达水平最高。DCAF8基因在浆细胞骨髓瘤中的突变率位于各肿瘤细胞系的第一位。DCAF8蛋白在多种MM细胞系中的表达量显著升高(P<0.01)。DCAF8表达量与MM患者的肿瘤负荷显著正相关,1q21扩增阳性组的DCAF8的表达量显著高于1q21阴性组。ROC曲线显示DCAF8的表达水平可以很好地区分MM患者和正常人(P<0.01)。DCAF8高表达组比DCAF8低表达组中位生存时间显著缩短。蛋白互作网络显示DCAF8可与XPO1蛋白直接相互作用。GO和KEGG功能富集分析结果表明,DCAF8与蛋白酶体功能、剪切体活性、组蛋白乙酰化酶活性、RNA转运等功能相关。结论:DCAF8在MM中显著高表达,其表达水平可以很好地区分MM患者和正常人;其高表达与MM患者的生存预后显著负相关,且与1q21扩增和XPO1蛋白相关。

TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测克罗诺杆菌MMS基因方法的建立

目的建立克罗诺杆菌的特异、灵敏的TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测方法。方法根据GenBank公布的克罗诺杆菌MMS基因高保守序列,设计特异引物和TaqMan-MGB探针,建立和优化反应体系,用25种其他常见致病菌评价反应体系的特异性,用克罗诺杆菌MMS基因重组质粒构建实时荧光定量PCR标准曲线,对重组质粒、纯菌和人工模拟污染样本进行灵敏度试验,并与FDA推荐的TaqMan探针实时荧光PCR比较,配对t检验分析两种方法对Ct值和荧光强度的差异。结果采用TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测克罗诺杆菌MMS基因仅需40 min,与25种非目标菌无交叉反应,仅对克罗诺杆菌有特异性扩增;所构建方法线性关系良好,相关系数r2=0.999,扩增效率为99.972%,对重组质粒、纯菌、人工模拟污染样品标本的灵敏度分别达10拷贝/反应、3.8和38 cfu/ml;与FDA推荐的TaqMan探针实时荧光PCR相比,TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR的Ct值更小、△Rn值更高,灵敏度和分辨率差异均有统计学意义(Ct:t=-14.406,P﹤0.01;△Rn:t=14.230,P﹤0.01)。结论本研究建立的TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR反应体系能够快速、特异、灵敏地检测克罗诺杆菌MMS基因,可用于婴幼儿奶粉中克罗诺杆菌的快速筛查和鉴定,具有较大的的应用价值和推广价值。

靶向BCMA的第二代/三代CAR-T细胞构建及其抗肿瘤活性的体外研究

该研究利用基因工程方法构建包含4-1BB或ICOS的第二代Anti-BCMA慢病毒表达载体,以及同时包含这两个共刺激因子的第三代Anti-BCMA慢病毒表达载体,通过制备相应慢病毒感染人CD3+T细胞,分别获得靶向BCMA的第二代和第三代CAR-T细胞。研究结果表明,以ICOS为共刺激因子及以4-1BB为共刺激因子的第二代CAR-T抗肿瘤活性相似,且在效靶比为2:1时,含ICOS共刺激因子比含4-1BB共刺激因子的第二代CAR-T细胞对U266-lucgfp细胞的杀伤效力更高;在效靶比为2:1、5:1和10:1时,第三代CAR-T细胞对U266-lucgfp细胞的杀伤效力低于第二代;在效靶比20:1时,第二代和第三代CAR-T细胞对U266-lucgfp细胞的杀伤效力都达到90%以上,显著高于对照组。综上所述,该研究成功构建了靶向BCMA的第二代和第三代CAR-T细胞,其可高效杀伤高表达BCMA的肿瘤细胞,且靶向BCMA的第二代CAR-T细胞比第三代对肿瘤细胞的杀伤效力更强。