Normal Mode Analysis on Three Different Structures of a Duplex DNA d(CGCGAATTCGCG)

Normal mode analysis in dihedral angle space was carried out on two X ray crystal structures and one model structure responded to the same sequence of duplex DNA: d(CGCGAATTCGCG). Comparing these results indicates that it is reliable and meaningful to carry out normal mode analysis on model structures. The reliability is greater except for the ends of helix.

西瓜炭疽病菌Colletotrichum orbiculare的分子检测

【目的】探索西瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)的分子检测技术,为西瓜、甜瓜等生长期和采后炭疽病的快速、准确鉴定和检测提供技术和方法。【方法】根据GeneBank中Colletotrichum属的24个种ITS序列,比较设计出1对引物CY1/CY2(CY1:5′-CTTTGTGAACATACCTAACC-3′;CY2:5′-GGTTTTACGGCAGGAGTG-3′);进一步利用RAPD随机引物扩增西瓜炭疽菌C.orbiculare和菜豆炭疽菌C.lindemuthianum,找出在C.orbiculare中的特异性条带,经过克隆、测序后,设计出1对SCAR引物RB/RC。【结果】引物CY1/CY2可以特异的从C.orbiculare和C.lindemuthianum菌株中扩增到1条442 bp的条带,将这2个种的炭疽菌和其它炭疽菌种以及其它真菌种分开。引物RB/RC可以特异地在C.orbiculare中扩增出1条216 bp条带,将C.orbiculare和C.lindemuthianum分开。采用2对引物组成双重PCR,将C.orbiculare进行特异性扩增,可获得442 bp和216 bp的2条特异性条带。【结论】利用上述2对引物组成双重PCR检测体系,快速鉴定C.orbiculare,并且能够直接在植物组织中将西瓜炭疽菌C.orbiculare检测出来,灵敏度可以达到1pg.μl-1。

基于多重氢键的寡聚芳酰胺自组装囊泡

六重氢键的异互补寡聚芳酰胺双股分子链在自组装过程中表现出极高的顺序专一性.本文借助扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)和动态光散射(DLS)等实验手段,研究了氢键编码顺序为DADDAD-DADDAD的寡聚芳酰胺分子1及异互补分子2(ADAADA-ADAADA)存在下的自组装行为.实验结果表明,分子1在四氢呋喃/甲醇(体积比为85/15)和单一溶剂丙酮中都能组装成大小均匀的囊泡结构,并且囊泡的尺寸随着溶液浓度的增加而增大;当加入异互补分子2后,囊泡则转变成实心球.利用荧光显微镜,发现该囊泡能很好地包裹荧光分子(罗丹明B),通过进一步分子结构修饰有可能实现药物包埋和缓释方面的应用.

香蕉穿孔线虫双重PCR快速检测技术研究

香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)是国际上公认的植物检疫性有害生物之一,是热带地区果树上最重要的线虫。通过设计的属水平上的特异性引物R1、R2(R1/2)和种水平上的特异性引物RS1、RS2(RS1/2)进行双重PCR扩增香蕉穿孔线虫,可扩增出长度为362和291 bp的2个特异性片段谱带。同时分别对检测体系中反应参数进行优化,最佳延伸温度为51.4℃,引物R1/2与RS1/2最佳浓度配比为0.2μm o.lL-1/1.2μmol.L-1,并测试检测引物的灵敏度,能进行有效检测的最低起始核酸量为100 pg;同时,也能对单条线虫进行检测以及样品中线虫的检测。专化性测试证明,2对引物能有效地进行香蕉穿孔线虫的快速分子诊断。

一步双重PCR检测香蕉枯萎病菌生理小种

通过设计特异引物PR1/PR2和ST1/ST2分别扩增出香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的DNA特异片段,优化检测体系的反应参数,建立了香蕉枯萎病菌生理小种双重PCR检测方法,检测体系的最佳退火温度为56℃,检测灵敏度的最低起始DNA为200pg。应用结果表明该体系有较高的准确性和稳定性,在1次PCR扩增中引物PR1/PR2和ST1/ST2能同时检测香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种。

双重PCR技术检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌方法的建立

【目的】利用双重PCR技术快速检测马铃薯环腐病菌(Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus)和黑胫病菌(Pectobacterium atroseptica)。【方法】根据GenBank上发表的马铃薯环腐病菌pCS1质粒上纤维素酶A基因序列,对比近缘种及马铃薯上几种重要病原菌的核苷酸序列,设计并合成了1对特异性引物CMS1/CMS2,将设计的引物与已发表的PCR检测马铃薯黑胫病菌特异性引物ECA1f/ECA2r结合,经过条件优化后,建立了双重PCR体系。【结果】利用引物CMS1/CMS2扩增出了1条913 bp的马铃薯环腐病菌特异性条带。检测灵敏度在DNA水平上达100 fg.μL-1,在细菌数上达105CFU.mL-1。利用双重PCR体系对马铃薯环腐病菌和黑胫病菌进行扩增,可获得913和690 bp的2条特异性条带。检测灵敏度在DNA水平上达600 fg.μL-1,在细菌数上达5×105 CFU.mL-1。【结论】成功建立了双重PCR检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌技术体系,该技术能够同时快速可靠地检测出马铃薯环腐病菌和黑胫病菌。

贝西滑刃线虫双重PCR检测方法研究

为实现贝西滑刃线虫的高效、准确鉴定,根据贝西滑刃线虫核糖体28SrRNA-D2/D3片段的保守区域设计了特异性引物,并结合植物寄生线虫通用引物作为内标,构建了贝西滑刃线虫的一步双重PCR检测体系。结果表明:特异性引物GU-F/GU-R对贝西滑刃线虫具有高度的特异性,扩增出245bp的特异性目标片段,有效检测灵敏度可达0.125ng/μL线虫DNA模板量。该方法特异性好、灵敏度高、稳定性强,适用于贝西滑刃线虫的快速检测。

一步法复合RT-PCR鉴别ND强毒与AI病毒的研究

根据新城疫病毒(NDV)融合蛋白和禽流感病毒(AIV)核蛋白的核酸序列设计2对引物,对NDV和AIV的特异扩增片段分别为156 bp和219 bp,建立了同时检测强毒力NDV和AIV核酸的一步法复合RT-PCR。试验中未能检出弱毒力NDV,IBV,IBDV,REV,REOV及SPF鸡肌肉组织的RNA,从不同年代分离的16个NDV强毒株全为阳性而NDV弱毒株全为阴性。经验证,复合引物与单一引物的扩增效率一致,能够检出NDV和H5亚型AIV的最低病毒量分别为103.7EID50和103.9EID50。试验结果表明,此次建立的一步法复合RT-PCR特异、敏感,适用于强毒力NDV和AIV感染的快速鉴别。

二聚体蝎型探针荧光定量PCR快速检测志贺菌方法的建立及初步应用

目的利用二聚体蝎型荧光探针法,建立一种可广泛应用且敏感、特异的检测志贺菌的荧光定量PCR技术。方法根据编码志贺菌ipaH基因的核苷酸序列设计引物和荧光探针,采用基因重组技术构建用于志贺菌检测的定量标准品,通过对荧光定量PCR反应体系和反应条件的摸索,建立了检测志贺菌的二聚体蝎型探针定量PCR方法。结果成功构建了志贺菌重组质粒标准品和志贺菌实时荧光定量PCR方法;通过特异性、敏感性、稳定性和重复性验证,结果表明具有较好的特异性、敏感性、稳定性和重复性;对比分离培养标本,二者符合率为100%;对比TaqMan方法,本方法具有更敏感、省时、成本低的特点。结论建立了一种以二聚体蝎型荧光探针技术为基础的志贺菌荧光定量PCR检测法,为研制新型的检测试剂盒奠定了基础,可应用于食品卫生监管以及传染病诊断等。

小麦优质Ax1/Ax2~＊和Dx5亚基的二重AS-PCR分子鉴定

为了提高小麦Glu-A1位点Ax1/Ax2*亚基和Glu-D1位点Dx5亚基分子标记鉴定效率,方便小麦分子水平的辅助选择及品种评价,建立了小麦高分子量谷蛋白Ax1/Ax2*亚基及Dx5亚基基因的二重AS-PCR反应体系。结果表明,PCR鉴定结果与SDS-PAGE电泳结果一致。利用建立的二重AS-PCR稳定扩增体系鉴定了21份外引小麦品种系的谷蛋白Glu-A1及Glu-D1位点,有7个品种扩增出1500bp特异片段,表明具有Ax1/Ax2*亚基;有11个品种扩增出478bp特异片段,表明具有Dx5亚基;小麦优质Ax1/Ax2*亚基和Dx5亚基出现百分率分别为33.3%和52.4%。该反应体系扩增稳定,可同时鉴定Ax1/Ax2*亚基及Dx5亚基,适用于优质小麦新品种的辅助选择。

利用RAPD技术对碧桃种质资源的分析

利用RAPD技术,采用从200个随机引物中筛选的22个随机引物对8个碧桃类型的基因组DNA进行扩增,通过扩增的180个位点的谱带的聚类,分析供试碧桃的系统发育,并运用特殊谱带,建立了碧桃的分子检索表,并提出了重点保存的碧桃种质。

不同分子结构聚酰亚胺固-液复合摩擦学行为与润滑机理研究

设计合成了一种新型热固性聚酰亚胺(TPI)材料,利用DMA242C型动态热机械分析仪、万能试验机以及接触角测量仪等对其机械性能、热学性能以及表面基础油PAO10的润湿性能进行表征,并与商业化的热塑性聚酰亚胺YS-20作对比,考察了两种不同分子结构的聚酰亚胺(PI)在PAO10润滑下的摩擦学行为.球-盘摩擦试验结果表明,无论是在模拟的多次“启-停”往复运动,还是模拟一次“启-停”的旋转接触运动,TPI与PAO10的固-液复合体系均具有优异的抗磨减摩性能,主要归因于TPI与PAO10之间较好的润湿性与物理吸附作用.通过分子动力学模拟的方法,进一步验证了空间化学交联TPI的空间化学交联结构增强了其表面与PAO10之间的物理吸附作用,有助于提高边界膜的构筑速度与承载能力,进而改善了两者复合体系的摩擦学行为.

非洲猪瘟病毒p72和CD2v双基因实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为了建立一种快速、准确、敏感的非洲猪瘟病毒p72和CD2v基因双重荧光定量PCR方法,根据GenBank公布的ASFV基因序列,针对p72基因保守区域和CD2v基因保守区域分别设计特异性引物和探针,并且对反应条件进行了优化。结果显示,该方法对ASFV p72、CD2v基因呈现特异性扩增,对猪瘟病毒(CSFV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪肺炎支原体均无扩增。建立的方法可检出低至7.3 copies/μL~24.5 copies/μL的ASFV核酸。用建立的方法检测2017年以前保存的105份来自国内猪场的血清和组织样本,105份样品均无ASFV核酸扩增。用该方法检测5份ASFV灭活参考样品,符合率为100%。说明建立的方法快速、敏感、准确,可用于ASFV的分子诊断和监测。

双重PCR检测马铃薯晚疫病菌和青枯病菌方法的建立及应用

利用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增马铃薯晚疫病菌转录间隔区并进行序列测定,通过序列比较,设计了1对马铃薯晚疫病菌的特异引物INF1/INF2,并对15种不同真菌、细菌和7种疫霉属和腐霉属卵菌基因组DNA进行PCR扩增,结果只有不同来源的马铃薯晚疫病菌株可获得324 bp的特异带。将引物INF1/INF2与卵菌通用引物进行巢式PCR扩增后,其检测灵敏度在DNA水平上可达30 fg。运用设计的引物与马铃薯青枯病菌特异引物结合建立了双重PCR体系,能从马铃薯晚疫病菌和马铃薯青枯病菌总基因组DNA以及人工接种和自然发病的马铃薯植株中分别或同时扩增到324 bp和281 bp的特异片段。实现了同时对马铃薯晚疫病菌和马铃薯青枯病菌的快速可靠检测。

双重realtimePCR定量测定小麦条锈菌潜伏侵染方法的建立与应用

小麦条锈病是我国小麦生产上的重要病害之一。为高效准确地定量检测处于潜伏侵染阶段的小麦条锈菌,本研究根据已发表的小麦条锈菌和寄主小麦的引物,设计了各自的探针,建立了双重real-time PCR检测方法。为排除多个引物互作造成的干扰,对小麦条锈菌引物探针体系、小麦体系以及二者的双重real-time PCR体系进行了比较。CT值相关线性回归分析证明,引物之间互作很小,对定量检测无影响。已知浓度样品经梯度稀释,进行灵敏度检测,确定了双重real-time PCR对小麦条锈菌DNA和小麦DNA准确定量测定的最小检测限为0.4 pg和0.5 ng。同时建立了小麦条锈菌和小麦各自的标准曲线。用此方法检测来自两个不同地区的田间样本,得到的分子病情指数(MDI)与随后的发病趋势一致。本研究建立的双重real-time PCR分析方法可靠、高效、低误差,是对本实验室已有小麦条锈菌潜伏期分子检测方法的进一步优化。

一种可视化双重荧光RT-LAMP方法鉴别不同毒力新城疫病毒

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测技术具有快速、敏感、仪器简单的优势。为了达到多重鉴别检测的目的,将分子信标引入LAMP反应体系,建立一套鉴别不同毒力新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的可视化双重荧光RT-LAMP方法。分别设计2套扩增不同毒力ClassⅡNDV F基因的LAMP引物,针对区分NDV毒力的分子标志F蛋白裂解位点的基序差异设计2条分子信标。中、强毒NDV分子信标5′端标记FAM荧光基团,3′端标记Dabcyl淬灭基团;弱毒NDV 5′端标记CY5荧光基团,3′端标记BHQ3淬灭基团。用经过条件优化的RT-LAMP体系对不同毒力NDV及其他病原进行鉴别检测,结果显示,LAMP引物能特异地扩增ClassⅡNDV,在荧光成像仪下,中、强毒NDV显示绿色荧光,弱毒显示红色荧光,混合感染显示黄色荧光,而其他家禽常见病原无荧光显示;以体外转录的NDV ssRNA片段为模板,建立的RT-LAMP反应体系最低检测限度为100 copies/μL;随机检测疑似NDV病料20份,鉴定结果与经分离、测序鉴定的结果一致。本研究建立的分子信标与LAMP结合的检测方法,可为NDV多重检测提供新的思路。

长岭发垫刃线虫(Trichotylenchus changlingensis)双重PCR检测方法研究

长岭发垫刃线虫（Trichotylenchus changlingensis）是一种迁移性植物外寄生线虫,该线虫于2011年首次在我国吉林省长岭县发现,并根据其形态特征及最新分类系统将其归为发垫刃属[1,2]。该线虫能引起玉米叶片黄化,植株矮化,茎基部开裂,茎节缩短等症状,该病发生率普遍在21%～67%,给玉米生产造成了严重影响[3]。

苯胺取代白叶藤碱衍生物与双链DNA相互作用的光谱及分子对接研究

运用紫外吸收光谱法研究了苯胺取代白叶藤碱衍生物与小牛胸腺DNA的结合作用:光谱实验结果表明,衍生物可能是以嵌插方式与小牛胸腺DNA结合。并运用Surflex-dock方法对衍生物与双链DNA的相互作用进行了分子对接研究,分析了小分子和受体的结合模式:对接结果表明,化合物插入到双螺旋DNA的碱基对中间,化合物与双链DNA的主要通过π-π堆积作用来相互结合。紫外实验和分子对接理论研究结果一致,两者相互补充,能够从实验和理论两方面协同研究药物分子与DNA之间的相互作用。

双重PCR检测板栗疫病菌的研究

由板栗疫病菌(Cyphonectria parasitica)引起的板栗疫病是板栗栽培区的主要病害,也是全国林业危险性有害生物。为建立C.parasitica的快速分子检测技术,根据C.parasitica与Gen Bank中同属其他物种的ITS序列差异设计了引物CP1/CP2,扩增了大小为285 bp的目的片段。进一步用RAPD技术从供试菌株中标记出C.parasitica的特异性片段,通过对RAPD特异片段克隆、测序后设计引物SC1/SC2,扩增的目的片段大小为389bp,实现了RAPD标记向SCAR标记的成功转化。采用引物对组合方式将引物CP1/CP2和SC1/SC2组成双重PCR,优化PCR反应条件并检测引物的特异性和灵敏度。双重PCR能从C.parasitica扩增出285 bp和389 bp的两条特异条带,而其他供试菌株及阴性对照均无条带,检测灵敏度达到300 fg/μL的基因组DNA。利用双重PCR能成功检测出自然条件下已发病板栗及处于潜伏期病害中的C.parasitica。