鼠抗人sIL-6R单克隆抗体的制备及sIL-6R检测方法的建立

以重组人ｓＩＬ－６Ｒ蛋白作为抗原，获得３株分泌特异性ＭｃＡｂ的杂交瘤株，分别命名为ＳＩ１０，ＳＩ１１和ＳＩ１２。３株ＭｃＡｂ均属小鼠ＩｇＧ１亚类。竞争抑制试验的结果表明，３株ＭｃＡｂ识别两个不同的抗原表位。将杂交瘤细胞注入同系小鼠腹腔诱生的ＭｃＡｂ腹水，经ｐｒｏｔｅｉｎＧ纯化后用生物素标记，建立了双ＭｃＡｂ夹心ＥＬＩＳＡ法，该法用于血清ｓＩＬ－６Ｒ的特异性检测，灵敏度为５０μｇ／Ｌ。

抗人白介素6受体单抗的制备和鉴定

利用重组人可溶性ＩＬ－６受体免疫小鼠后，制备了两株抗人ＩＬ－６Ｒ的单克隆抗体１７６／Ｂ６和１５１／Ｈ１２。两者分别识别ＩＬ－６Ｒ胞外肽段的近膜区和远膜区。免疫印迹分析表明，两株单抗均能够特异地结合天然的膜ＩＬ－６Ｒ蛋白，然而都不能阻断ＩＬ－６Ｒ的生物功能。

抗人IL-6Rβ(gp130)单克隆抗体对IL-6信号分子调控浅析

目的:分析鼠抗人IL-6Rβ(gp130)单克隆抗体[anti-IL-6Rβ(gp130)mAb]的生物学特性及对IL-6信号分子的调节作用。方法:利用Western blot、竞争性ELISA实验、功能表位结合实验,检测anti-IL-6Rβ(gp130)mAb的亲和力、效价及与gp130抗原表位结合特异性。进而探讨anti-IL-6Rβ(gp130)mAb对U266细胞、RA患者外周血单个核细胞(PBMC)及滑膜液单个核细胞(SFMC)增殖和分化中的IL-6信号分子的调控机制。结果:Anti-IL-6Rβ(gp130)mAb对gp130具有高亲和性(如10A1细胞株的亲和力常数可达为2.62E-10),所获得的多株单抗还具有针对不同抗原结合表位的特性,可用于分析和研究IL-6信号通路及下游STAT3的磷酸化。结论:获得针对不同抗原结合表位的anti-IL-6Rβ(gp130)mAb,初步的实验结果表明此类单抗不仅具有调控IL-6信号分子和下游STAT3磷酸化的生物学功能,并为解析临床RA的发病与IL-6信号分子的关联性提供了初步的实验结果。

在共培养体系中单克隆抗体AH_6对小鼠胚泡着床的影响

以单克隆抗体ＡＨ６［特异结合ＬｅＹ寡糖，Ｆｕｃα１２Ｇａｌβ１４（Ｆｕｃα１３）ＧｌｃＮＡｃ］以及其它３种与ＬｅＹ寡糖结构近似的寡糖特异结合的单克隆抗体αＬｅａ、αＬｅｂ和ＦＥＡ５为工具，采用小鼠体外着床模型，研究细胞表面ＬｅＹ寡糖抗原与着床的关系及其在着床过程中的具体作用环节。结果显示：不论子宫上皮细胞表面还是胚胎滋养层细胞表面的ＬｅＹ寡糖抗原被封闭后，都能导致胚胎在单层子宫上皮细胞表面粘附和扩展生长的延迟，但对胚胎最终的扩展程度并无影响，而其它３种单克隆抗体对胚胎的粘附则均无影响。说明这种作用具有明确的寡糖结构特异性。另外，运用免疫荧光方法观察到，胚胎在单层子宫上皮细胞表面的粘附与ＬｅＹ寡糖在细胞表面的消长密切相关。因而认为ＬｅＹ寡糖抗原在胚胎着床中可能是作为一种中介分子参与着床始发阶段的胚胎与母体间的识别和粘着。实验中经单克隆抗体处理后胚胎和单层子宫上皮细胞与对照组比较，其形态与发育未见不同。

IL-6单克隆抗体对自身免疫性心肌炎的保护作用及其机制

目的：观察白介素-6（interleukin，IL-6）单克隆抗体（IL-6 mAb）治疗Lewis大鼠自身免疫心肌炎（EAM）的疗效。探讨IL-6与辅助性T细胞17（Th17）、调节性T细胞（Treg）在EAM发病中的机制。方法：将34只8-10周龄Lewis大鼠随机分为正常对照组（n=6），EAM组（n=12），IL-6mAb干预组（n=16）。对EAM组和干预组注射心肌肌凝蛋白，干预组于免疫注射后第1、7至第20天腹腔注射IL-6 mAb1nlg，分别于急性峰值期（第21天）、慢性持续期（第84天）取材，观察心肌炎症浸润、纤维化、细胞凋亡以判断IL-6mAb疗效。检测脾脏TH17、Treg细胞数量和功能，比较各组血清中IL-6、IL-10、IL-17和转化生长因子．β（TGF-β）的浓度，实时定量PCR测定外周血STAT3、RORγt、Foxp3mRNA水平，对EAM源性脾细胞进行体外IL-6mAb刺激，并用ELISA法测定IL-10、IL-17和TGF-β的浓度。结果：炎症积分、纤维化积分、凋亡指数IL-6mAb干预组较EAM组明显下降（P〈0．01）。急性峰值期（21d组）EAM组TH17和Treg细胞数量上调，干预组则受明显抑制（P〈0．01）；21d干预组血清IL-6、IL-10、IL-17和TGF-β的浓度较EAM组明显下降（P〈0．01）；21d干预组外周血STAT3、RORγt、Foxp3mRNA水平下降（P〈0．01）；体外IL-6mAb刺激EAM源性脾细胞，IL-10、IL-17和TGF-β表达明显增加。结论：IL6mAb对EAM有明显的保护作用，IL6mAb通过抑制Th17、Treg细胞的数量和功能，实现对EAM的保护作用。

人源化白细胞介素-6受体抗体治疗全身型幼年特发性关节炎的疗效及安全性

目的:探讨人源化IL-6受体抗体(托珠单抗注射液)治疗全身型幼年特发性关节炎(sJIA)的临床疗效及安全性。方法:回顾性分析2015年12月—2016年11月在浙江大学医学院附属儿童医院应用托珠单抗治疗的13例sJIA患儿的临床资料,包括血常规、C反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)、IL-6、血清铁蛋白、美国风湿病学儿科(ACR Pedi)30/50/70/90评分、激素使用情况以及治疗期间的不良反应。结果:与治疗前比较,治疗后第3天患儿的CRP和ESR明显下降(均P<0.05);治疗后第2周血红蛋白增加和血小板减少(均P<0.05);第4周血清铁蛋白水平下降(P<0.05);白细胞在治疗后第8周时减少(P<0.05)。IL-6水平在治疗后先上升,第4周时下降,但与治疗前比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。治疗第4周ACR Pedi 30或以上达100%;第20周时,61.5%的患儿达到ACR Pedi 90和停用糖皮质激素。随访至20周,所有患儿共发生不良反应22例次,其中感染发生率占54.5%(12/22),无严重不良反应发生。结论:托珠单抗能快速控制sJIA炎症,改善疾病活动度,有助于糖皮质激素的顺利减量及停药,且安全有效。

抗人类疱疹病毒6型南京分离株E5单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备并鉴定人疱疹病毒6型(HHV-6)单克隆抗体。方法:用纯化的HHV-6南京分离株E5免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,经间接ELISA法筛选,间接免疫荧光法、免疫印迹实验等方法鉴定单抗。并采用套式PCR法和ELISA法,在口腔癌中进行了初步的应用。结果:获得了一株分泌抗HHV-6单克隆抗体的杂交瘤细胞系,命名为JA9。单克隆抗体亚类鉴定表明:其为IgG1亚类,轻链为κ。用间接ELISA法检测细胞上清单抗效价为1∶500;单抗腹水滴度为1∶8.0×104。免疫印迹实验结果表明:JA9单抗腹水与约75kuHHV-6E5病毒蛋白结合。口腔癌患者唾液的HHV-6阳性检测率结果分别是:套式PCR法60%,ELISA法40%。结论:成功制备并鉴定一株抗HHV-6南京分离株E5单克隆抗体,为HHV-6进一步的基础研究及临床快速诊断提供可能。

一组抗人重组IL－6单克隆抗体的制备及鉴定

以基因重组的人ＩＬ－６免疫了Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，利用小鼠杂交瘤技术，建立了２０余株分泌抗人重组ＩＬ－６单克隆抗体的杂交瘤，并对其中的Ｃ＿（９２）、Ｃ＿（９７）、Ｃ＿（２０３）、Ｃ＿（２２０）进行了较系统的鉴定，其抗体类别均为ＩｇＧ，亚类分别为ＩｇＧ＿（２ａ）、ＩｇＧ＿１、ＩｇＧ＿（２ａ）和ＩｇＧ＿（２ａ）。它们均特异性地识别ＩＬ－６，而与多种其它因子和无关蛋白无交叉反应。免疫转印结果显示，各单抗均能识别分子量为１７ｋＤ的ＩＬ－６单一条带，并具有中和ＩＬ－６生物活性的效应。

抗白细胞介素6单克隆抗体抑制小鼠心脏移植急性排斥反应及其机制

目的观察抗白细胞介素6(IL-6)单克隆抗体(anti-IL-6monoclonal antibody,anti-IL-6mAb)对同种异体小鼠心脏移植急性排斥反应的抑制作用,并探讨其可能作用机制。方法建立小鼠颈部异位心脏移植模型。实验动物随机分为同系移植组、移植模型组、移植对照组(注射rat-IgG)和移植治疗组(注射anti-IL-17mAb或anti-IL-6mAb)。观察各组移植心脏存活时间并检测病理组织学改变;Real-time PCR检测各组移植心脏中细胞因子IL-17、干扰素-γ(IFN-γ)及Th17细胞特异性转录因子RORγt mRNA表达水平,流式细胞术检测各组受鼠脾脏CD4+、CD8+T细胞中IL-17、IFN-γ的表达水平。结果①anti-IL-6mAb、anti-IL-17mAb输注均可显著抑制小鼠急性排斥反应的发生,移植心脏存活时间分别延长至(22.0±2.3)d、(13.0±1.8)d,anti-IL-6mAb组抑制排斥反应发生的效果更加显著。组织病理学结果显示anti-IL-6mAb组排斥反应病理分级明显下降(Stanford 2级);②anti-IL-6mAb组移植心脏中IL-17、IFN-γ和RORγt mRNA的转录水平较rat-IgG对照组及移植模型组显著下降,anti-IL-17mAb输注可部分下调IFN-γmRNA的转录水平;③anti-IL-6mAb组受鼠脾脏CD4+及CD8+T细胞中IFN-γ+的比例均有不同程度的下降,且CD4+IFN-γ+T细胞较CD8+IFN-γ+T细胞下降更为明显,同时CD4+IL-17+T(Th17)细胞的比例在anti-IL-6mAb组中亦明显下降。结论 anti-IL-6mAb可有效抑制急性排斥反应小鼠体内Th17和Th1细胞的活化,并延长同种异体心脏移植物的存活时间。

结核分枝杆菌ESAT-6抗原鼠单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的:制备重组结核分枝杆菌ESAT-6抗原鼠单克隆抗体。方法:采用杂交瘤技术,获得了12株针对结核分枝杆菌ESAT-6抗原的鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株,对其中的5株进行了小鼠腹水的制备及相关鉴定。结果:5株单克隆抗体的腹水效价达到1:512 000～1:1 024 000,纯化后纯度高于90%,抗体亚类(型)均为IgG1/κ型,ELISA结果显示制备的单克隆抗体与结核分枝杆菌ESAT-6抗原可发生特异反应。结论:制备了结核分枝杆菌ESAT-6抗原鼠单克隆抗体,为结核分枝杆菌ESAT-6的生物学功能研究奠定了基础。

白细胞介素6单克隆抗体的研制

采用纯化的工程菌表达产物白细胞介素６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ６，ＩＬ－６）免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞（ＳＰ２／０）在ＰＥＧ作用下进行融合，通过ＥＬＩＳＡ筛选并多次亚克隆，获得了１株能分泌抗ＩＬ－６单克隆抗体的杂交瘤细胞Ｉｃ－１．３．４．５。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ显示：抗体结合抗原的分子量与ＩＬ－６相符，为特异性抗ＩＬ－６抗体。亚类鉴定表明：该细胞分泌的单克隆抗体为ＩｇＧ１亚类，ｋａｐｐａ型。染色体数目为１００条左右。腹水效价为１１０４，无血清培养液效价为１１０２。此杂交瘤细胞株体外传代培养６个月以上，ＥＬＩＳＡ检测抗体滴度无明显降低。

抗白细胞介素6单克隆抗体治疗延长小鼠同种心脏移植物存活时间的实验研究

目的观察应用抗白细胞介素6(IL-6)单克隆抗体(anti-IL-6 monoclonal antibody,anti-IL-6 mAb)对同种异体小鼠心脏移植排斥反应的抑制作用,并探讨其可能的作用机制。方法建立小鼠颈部异位心脏移植模型。实验动物随机分为同系移植组、移植治疗组(每日注射3 g/L anti-IL-6 mAb 0.1 mL)和移植模型组(注射等量生理盐水)。ELISA法检测受鼠移植术后第3、6天外周血IL-6的表达水平,观察各组移植心脏存活时间,病理分析检测排斥反应程度,流式细胞术(FCM)检测各组受鼠脾脏及移植心脏中CD4+CD25+调节性T细胞比例变化,RT-PCR检测移植心脏IL-6I、FN-γI、L-17、RORγt和Foxp3 mRNA的表达水平。结果①治疗组外周血IL-6表达水平较模型组明显降低(P<0.01);②治疗组移植心脏存活时间较模型组明显延长[(22.0±2.3)d vs(7.7±0.8)d,P<0.01],排斥反应病理分级明显下降(Stanford 2级);③治疗组移植心脏中IFN-γI、L-6I、L-17和RORγt mRNA表达水平较模型组显著下降(均P<0.05),脾脏及移植心脏中浸润的CD4+CD25+调节性T细胞比例及Foxp3 mRNA表达水平均明显升高,与模型组比较差异有统计学意义(均P<0.05)。结论anti-IL-6 mAb治疗可抑制Th1、Th17型细胞因子的分泌,促进CD4+CD25+Foxp3+T细胞产生,抑制单个核细胞浸润并有效延长小鼠同种移植心脏的存活时间。

甲基强的松龙、环磷酰胺、抗IL-6单抗体外诱导SLE患者血中淋巴细胞凋亡的研究

目的探讨甲基强的松龙(MP)、环磷酰胺(CTX)及抗IL-6单抗(mAb)对系统性红斑狼疮(SLE)患者血中淋巴细胞凋亡的影响。方法通过将MP、CTX和抗IL-6 mAb分别与活动期SLE患者外周血淋巴细胞共同培养不同时间,利用流式细胞仪检查各时间点淋巴细胞的凋亡情况。结果与健康对照组比较,MP具有明显诱导SLE患者血中淋巴细胞凋亡的作用,CTX除此作用外,尚可引起继发性坏死淋巴细胞的增加;抗IL-6mAb诱导淋巴细胞凋亡的作用与CTX无差异,但无引起继发性坏死淋巴细胞增加的作用。结论MP,CTX及抗IL-6mAb体外均可诱导SLE患者血中淋巴细胞凋亡,对探讨SLE新的治疗方法具有一定的意义。

抗HPV-16E_6单抗对宫颈癌靶向性的研究

目的 :评价抗HPV - 16E6 单克隆抗体靶向定位于宫颈癌组织的能力。方法 :用99Tcm 标记抗HPV - 16E6 单克隆抗体 (抗HPV - 16E6 +McAb ,实验组 )和正常鼠免疫球蛋白 (nMIgG ,对照组 )后 ,分别进行荷HPV - 16E6 +U14宫颈癌小鼠放射免疫显像 ,并比较放免结果。结果 :99Tcm 抗HPV - 16E6 McAb及99Tcm-nMIgG标记率分别为 91.97%和92 .4 9% ;标记前后抗体的免疫活性未改变 ;2 4h显像可见实验组肿瘤部位放射性浓集 ,图象清晰 ,肿瘤和非肿瘤组织放射性比值 (T/NT)明显高于对照组 (P <0 .0 5 )。结论 :抗HPV -16E6 单克隆抗体具有特异性定位于宫颈癌组织的能力 。

白细胞介素－6的^（125）I标记及在单抗筛选中的应用

采用氯胺－Ｔ法对白细胞介素－６进行^（１２５）Ｉ标记，标记率和标记产品的纯度高，游离^（１２５）Ｉ很低。用本标记产品筛选抗ＩＬ－６单克隆抗体的实验结果显示它的结合率高而稳定。本法灵敏度高、特异性强，是一种快速、便于进行单克隆抗体筛选的微量免疫检测法。

分泌抗rHuIL－6McAb杂交瘤细胞系的建立及其应用研究

应用常规方法建立了４株稳定分泌抗重组人ＩＬ－６（ｒＨｕＩＬ－６）单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的小鼠杂交瘤细胞系１Ｈ３、２Ａ１０、３Ａ３和４Ｂ１。其中，１Ｈ３为ＩｇＧ２ｂ（ｋ），２Ａ１０为ＩｇＧ１（ｋ），３Ａ３和４Ｂ１为ＩｇＧ２ａ（ｋ）。４株ＭｃＡｂ特异性强，与细胞因子ＩＬ－１β、ＩＬ－３、ＩＬ－８、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＳＣＦ、ＩＣＡＭ－１，以及受体菌菌体蛋白成分均无交叉反应。间接ＥＬＩＳＡ测定小鼠腹水ＭｃＡｂ效价为１０（－６）～１０（－８）。应用识别不同表位的ＭｃＡｂ建立了双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法检测ＩＬ－６，敏感性为１００ｐｇ／ｍｌ。初步应用表明可用于临床标本的检测。

《欧洲药典》6.0版与7.5版单克隆抗体总论的介绍与比较

目的介绍《欧洲药典》7.5版在6.0版基础上单克隆抗体总论所做的修订和变化,为2015年版《中国药典》三部中单克隆抗体总论的起草和完善提供参考。方法对《欧洲药典》6.0版和7.5版单克隆抗体总论进行列表比对分析,了解《欧洲药典》对于单克隆抗体产品安全性、有效性和质量可控性的新的关注点和要求,并对2015年版《中国药典》三部单克隆抗体总论的起草提出几点建议。结果与结论《欧洲药典》7.5版比6.0版表述更加严谨,对于生产过程的控制和要求更为合理,充分体现了质量源于设计以及质量风险控制的理念。

抗DR5单克隆抗体对NCL-H446的致凋亡作用

目的:探讨抗DR5单克隆抗体(mDRA-6)对小细胞肺癌NCL-H446的凋亡作用。方法:NCL-H446细胞常规培养24 h后分为对照组、抗DR5单克隆抗体(mDRA-6)及mDRA-6+顺铂处理组。以细胞形态学改变、流式细胞仪和DNA凝胶电泳分析为凋亡观察指标。结果:经mDRA-6处理的NCL-H446细胞出现核固缩、染色质边缘化和凋亡小体形成;琼脂糖凝胶电泳呈现细胞凋亡特征性DNA梯状带;细胞凋亡发生率与抗DR5单克隆抗体(mDRA-6)剂量及细胞表面DR5的表达呈相关性。结论:mDRA-6对小细胞肺癌NCL-H446的杀伤作用主要通过诱导凋亡实现的,细胞表面DR5受体表达上调可促进凋亡作用。

mDRA-6与尼美舒利对Jurkat细胞的杀伤效应

目的:探讨mDRA-6与尼美舒利对Jurkat细胞有无杀伤作用及二者有无协同效应。方法:常规培养Jurkat细胞,流式细胞术检测细胞表面DR5的表达率,MTT法检测细胞毒性作用,Hoechst33258染色观察Jurkat细胞核形态变化,流式细胞术定量分析凋亡细胞率。结果:①Jurkat细胞表面DR5的表达率为84.83%。②mDRA-6与尼美舒利均能杀伤Jurkat细胞,存在浓度依赖性。400μmol/L的尼美舒利作用细胞10小时,细胞凋亡率为11.51%;0.5ng/ml与1ng/ml的mDRA-6作用细胞10小时,细胞凋亡率分别为3.67%和6.3%;③二者联合具有较好的协同促凋亡作用,400μmol/L的尼美舒利联合0.5ng/ml与1ng/ml的mDRA-6作用细胞10小时,细胞凋亡率分别为50.38%和63.79%。结论:mDRA-6与尼美舒利均有杀伤Jurkat细胞的作用,二者具有较强的协同作用,杀伤作用是通过诱导凋亡实现的。

人组织激肽释放酶6双抗夹心ELISA方法的建立及临床初步应用

目的通过制备的人组织型激肽释放酶6(hK6)单克隆抗体(mAb),建立双抗夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)检测方法,并用于胃癌诊断。方法采用该实验室保存的hK6重组蛋白,免疫BALB/c小鼠后通过杂交瘤技术制备特异性的mAb,经鉴定纯化、酶标记后,建立双抗夹心ELISA方法,检测胃癌患者血清中hK6水平,并联合检测血清中的癌胚抗原(CEA)水平,探讨hK6作为胃癌生物标记的可行性。结果成功建立了检测血清中hK6的双抗夹心ELISA方法,并确定该方法包被抗体的最适浓度为5μg/mL,酶标记抗体的最佳稀释比例为1∶2 000。该方法检测各组血清中的hK6水平,与胃溃疡组hK6水平[(3.59±1.02)ng/mL]和健康体检组hK6水平[(3.35±0.67)ng/mL]比较,胃癌组hK6水平[(5.78±1.66)ng/mL]明显高于其他两组,差异有统计学意义(P<0.05);而胃溃疡组与健康体检组hK6水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。胃癌患者hK6和CEA检测的阳性率分别为69.70%和45.46%,两者联合检测的阳性率为78.79%。结论成功建立了hK6双抗夹心ELISA检测方法;hK6是较好的胃癌血清肿瘤标记物,同时检测hK6与CEA可提高胃癌的检出率,减少漏诊的发生,有助于胃癌的诊断。