高效利用木糖产油的氮离子注入Mortierella alpina诱变选育研究

木糖的有效利用是木质纤维素全利用的基础。为了获得高效利用木糖产油的高山被孢霉菌株,通过多轮氮离子束诱变,筛选出一株有效利用木糖的产油高山被孢霉I502-8(Mortierella alpina I502-8,MAI502-8),并研究了以葡萄糖/木糖(W/W,5/3)组成的混合糖为碳源,突变株生长和油脂积累的特性。采用单因子和正交实验对培养基组成和发酵条件进行了优化,结果表明,诱变菌在温度28℃,pH 8.0,接种量8%,装液量30%,蛋白胨0.76%和豆粕1%,分批补糖的最优发酵条件下发酵9d,生物量和菌体油脂积累量分别达29.8g/L和11.7g/L,较出发菌提高了2.59倍和2.05倍,同时原料糖利用率达到99.4%。

高山被孢霉低温应激条件下油脂代谢研究

对高山被孢霉在不同温度下的生物量、油脂产量和油脂组成等指标进行研究,并开展了比较代谢组学研究。结果表明:在低温处理(15℃)时,高山被孢霉的生物量和油脂含量均低于常温(25℃)处理。但是,在低温条件下高山被孢霉的极性脂含量提高到了2.53倍,而且极性脂中的不饱和脂肪酸含量提高到了1.32倍,表明高山被孢霉的低温保护机制启动,大量合成极性脂和不饱和脂肪酸用于抵御低温应激。差异化合物筛选发现其中与油脂合成和降解有关的有10个化合物,与糖酵解(EMP)途径有关的有6个化合物,与氨基酸合成、降解和转运相关的化合物有5个。

高山被孢霉NADP^(+)依赖型异柠檬酸脱氢酶的异源表达与活性分析

产油真菌胞质中NADP^(+)依赖型异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)能够为脂肪酸合成提供还原力,前期研究表明高山被孢霉的异柠檬酸脱氢酶4(Mortierella alpina isocitrate dehydrogenase4,MaIDH4)对脂质积累有积极的影响。为了深入研究MaIDH4的性质,该文将其在大肠杆菌和毕赤酵母系统中分别进行异源表达并纯化,均成功获得纯酶,并考察了不同表达系统对酶活性和产量的影响。首先克隆MaIDH4至表达载体pET28a(+)和pPink-HC-3CZHEK构建重组质粒,然后分别转化至Escherichia coli BL21(DE3)和PichiaPink TM Strain 2进行诱导表达,最后采用镍柱纯化获得携带10×His标签的MaIDH4重组酶,检测纯酶的比活力分别是34.10 U/mg和43.00 U/mg,酶产量分别为10.28 U/L和159.12 U/L。通过纯酶比活力和酶产量分析表明相比于大肠杆菌表达系统,毕赤酵母宿主更适合MaIDH4的异源表达。

高山被孢霉产多不饱和脂肪酸发酵条件优化

以玉米糖为碳源,酵母膏为氮源,以生物量和油脂产量为评价指标,通过单因素试验和正交试验优化高山被孢霉(Mortierella alpina)3.12824发酵条件,并采用气相色谱(GC)分析高山被孢霉油脂的组成。结果表明,最佳发酵条件为玉米糖80.0 g/L、酵母膏12.0 g/L、KH_(2)PO43.8 g/L、NaNO33.4 g/L、MgSO4·7H_(2)O 0.5 g/L、装液量200 mL/L、发酵时间7 d、发酵温度25℃、初始pH 6.5。在此优化条件下,高山被孢霉发酵后生物量及油脂产量分别达到26.23 g/L和8.98 g/L。经GC分析高山被孢霉产油脂组成为软脂酸(C_(16:0))、硬脂酸(C_(18:0))、油酸(C_(18:1))、亚油酸(C_(18:2))、十八碳三烯酸(C_(18:3))、花生三烯酸(C_(20:3))、花生四烯酸(C_(20:4))、二十二烷酸(C_(22:0)),其中不饱和脂肪酸C_(18:1)、C_(18:2)、C_(18:3)、C_(20:3)、C_(20:4)的含量分别为17.72%、5.73%、0.75%、5.83%、39.93%,其总含量超过69.00%,多不饱和脂肪酸(C_(18:2)、C_(18:3)、C_(20:3)、C_(20:4))的总含量超过52.00%。

被孢霉γ-亚麻酸高产菌株选育

利用紫外线复合氯化锂诱变高山被孢霉SM96,筛选出一株高产γ-亚麻酸的菌株TM11,产量比出发菌株(25mg/L)提高了近3倍。对影响其多不饱和脂肪酸产生的因子Mg2+,VB6,营养盐溶液,磷源,碳源,氮源酵母膏进行了正交试验,选出TM11最佳的培养基配方:MgSO4·7H2O1.0g,VB6150mg/L,酵母膏6g/L,葡萄糖100g/L,营养盐溶液1mL/L,K2HPO42g/L。在上述最佳培养基中TM11的生物量达18.0213g/L,总脂达10.8128g/L,GLA量达668mg/L。

高山被孢霉Δ^6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的胞内表达

γ 亚麻酸 (GLA)作为人体必需的不饱和脂肪酸 ,具有重要的营养和药用价值。Δ6 脂肪酸脱氢酶是γ 亚麻酸合成途径中的关键酶。为了在毕赤酵母中建立一种新的合成γ 亚麻酸的表达体系 ,将高山被孢霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因与胞内表达载体pPIC3 5K连接 ,SacⅠ线性化后电击法转化毕赤酵母SMD116 8,获得的转化子经PCR鉴定目的基因已整合到毕赤酵母的基因组中。用甲醇诱导表达 ,通过脂肪酸气相色谱和气相色谱 质谱 (GC MS)联用分析表明高山被孢霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中获得表达 ,γ 亚麻酸含量占总脂肪酸的 16 2 6 %。

YAG激光照射对高山被孢霉花生四烯酸产量的影响

花生四烯酸产生菌高山被孢霉的孢子在时间为 8m in,距离为 10 cm的 YAG激光剂量照射下 ,其致死率为 75 %～ 80 %。以该剂量反复进行照射及菌种筛选 ,得到其最高生物量 2 8. 6 g/L,油脂 11. 0 4 g/L,AA3. 10 g/L 的突变株 T1 0 5,比对照菌株的 AA产量及油脂量分别提高了 2 . 95倍和 1. 71倍。通过对突变株 T1 0 5的形态、代谢情况以及继代稳定性进行分析 ,认为 YAG激光诱变育种是获得花生四烯酸高产菌株的有效方法。

高山被孢霉挥发性次生代谢产物分析

1材料与方法 1．1试剂酵母粉为英国OXOID公司生产；葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O均为国产分析纯。 1．2仪器Thermo Finnigan TRACE DSQ型气相色谱-质谱联用仪；SUPELCO公司的SPME Fiber Assortment Kit #1固相微萃取头。

花生四烯酸产生菌的原生质体诱变育种

采用化学诱变剂硫酸二乙酯 (DES)对由高山被孢霉出发菌株M 3 18制备的原生质体进行诱变育种 .实验结果表明 ,采用体积分数为 10 %的DES诱变 3min ,可获得高产突变株M 2 0 ,其花生四烯酸产量比对照株M 3 18提高了 4.4倍 ,而且突变株的继代遗传稳定 .

花生四烯酸油脂高产菌株的选育

以高山被孢霉为出发菌株,抗氧化剂——没食子酸辛酯为筛选剂,经过紫外-LiCl复合诱变处理,筛选出抗脂肪酸脱氢酶抑制剂的菌株。将筛选出的菌株经过摇瓶发酵复筛,筛选到1株生产性能优于出发菌株的突变株R807。与原始菌株相比,该菌株的油脂组成脂肪酸分布中C18系列脂肪酸相对较少,花生四烯酸(ARA)占总脂肪酸的含量保持在40%(质量分数)以上。其菌体生物量达到39.2 g/L,油脂产量达到16.3 g/L,ARA占总脂肪酸含量为41.72%(质量分数),ARA产量达6.81 g/L。各数值比原始菌株分别提高了22.9%、3.2%、35.1%和39.8%。连续传代多次,其产量性状无显著变化。

微生物发酵法生产花生四烯酸油脂的研究进展

花生四烯酸(ARA)是一种重要的脂肪酸,现在主要由生物法生产,本文综述了高山被孢霉发酵生产花生四烯酸油脂的菌落形态控制及其代谢途径,以期为相关的研究者提供参考。

高山被孢霉三阶段培养法生产花生四烯酸油脂

为提高高山被孢霉(Mortierella alpina)生物合成花生四烯酸油脂的生产效率,基于花生四烯酸油脂的积累机制,建立了一种三阶段培养法:第一阶段在全培养基中培养促进菌体生物量的快速积累,确定了60 g/L糖初始质量浓度时,最有利于生物量的快速积累;第二阶段在C源丰富而其他营养缺乏的条件下培养,促进油脂快速积累,对糖最佳初始浓度、接种时间、pH和培养时间进行了优化;第三阶段培养诱导油脂中花生四烯酸的高效积累,并确定此阶段培养时间为36 h时为最佳时间。实验结果表明:三阶段培养工艺条件下,菌体生物量、油脂量、花生四烯酸量分别为41.6、26.6和11.4 g/L,本研究相比传统分批发酵工艺在产率和花生四烯酸最终产量方面都有了显著提高。

高山被孢霉DNA提取方法的比较与改进

利用CTAB法、SDS裂解法、氯化苄法和溶菌酶消化法提取高山被孢霉菌团的DNA。结果表明,CTAB法提取的DNA收率与纯度均较高,收率在700μg·g-1菌团以上,蛋白质污染少;SDS裂解法提取的DNA收率和纯度均较低,蛋白质污染严重;氯化苄法提取的DNA纯度较高,且无需苯酚纯化,但其易降解成DNA片段,质量稳定性较差;溶菌酶消化法无需采用液氮研磨,提取的DNA能达到分子生物学分析的要求,但收率较低,且步骤烦琐,成本较高。用改进的CTAB法可得到高纯度、高收率的被孢霉DNA,并可用于酶切或PCR扩增。

高山被孢霉的红四氮唑染色程度与菌体油脂中花生四烯酸含量的关系

研究了高山被孢霉菌体被红四氮唑(TTC)染色的条件,并探讨了染色程度与菌体油脂中花生四烯酸含量的关系.高山被孢霉的种子菌体被TTC染色的程度随种龄增加而增加,而种子中的油脂含量和油脂中的花生四烯酸含量也都随种龄增加而增加.在发酵过程中,菌体被TTC染色的程度和菌体中的油脂含量以及油脂中的花生四烯酸含量随培养时间增加而增加.三株具有相似油脂含量、不同花生四烯酸含量的高山被孢霉以及一株不产花生四烯酸的鲁氏毛霉的染色结果显示菌体被红四氮唑染色的程度与菌体油脂中的花生四烯酸含量具有正相关性.该发现有助于花生四烯酸高产菌的快速筛选.

高山被孢霉Δ5脱饱和酶基因的分离与验证

花生四烯酸(arachidonicacid)是人体的必需脂肪酸,具有独特的生物活性。Δ5脱饱和酶是花生四烯酸生物合成途径上的关键酶,以二高-γ-亚麻酸为底物,催化其第5位碳脱氢形成花生四烯酸。从花生四烯酸高产菌株高山被孢霉M6(Mortierellaalpina)中通过RT-PCR分离了可能的编码Δ5脱饱和酶完整的cDNA,其大小为1366bp,编码446个氨基酸。推导出的蛋白质含有Δ5脂酰脱饱和酶中保守的特征性结构域,包括该蛋白质N端典型的细胞色素b5结构域,以及3个保守的组氨酸盒。为验证该蛋白质的功能,将该基因片段克隆到穿梭表达载体pPIC9K中,获得的重组载体pPIC9K-D5通过电转化法转化到巴斯德毕赤酵母GS115中,利用G418耐受度筛选出高拷贝数的酵母转化子,在加入外源底物二高-γ-亚麻酸时,利用甲醇诱导酵母转化子表达外源基因。酵母转化子的油脂的气相色谱图谱中出现了一个花生四烯酸的特征峰,进一步对该峰进行气质联谱(GC-MS)分析,证实该峰是花生四烯酸。研究结果表明,从高山被孢霉M6中分离出Δ5脱饱和酶基因。

微波等离子体溅射诱变选育花生四烯酸高产菌及补料工艺研究

采用微波等离子(N+,15w,3min)溅射高山被孢霉T105,筛选到高产菌R254,该菌最高生物量29.3g/L,油脂11.5g/L,花生四烯酸4.20g/L,花生四烯酸产量是原出发菌株1.35倍。通过对突变株R245的代谢情况、继代稳定性以及脂肪酸组成分析,认为微波等离子溅射诱变育种是获得花生四烯酸高产菌株的有效方法。并采用补糖工艺可进一步提高其产量,花生四烯酸产量为7.43g/L,是未补糖时花生四烯酸产量的1.76倍,且为出发菌株花生四烯酸最高产量的2.40倍。

被孢霉产n-6多不饱和脂肪酸的分离纯化

对高山被孢霉 (Mortierellaalpina)高产脂变异株M2 0 产生的含n 6PuFAs油脂的提取、精炼、浓缩进行了研究 .油脂的提取以乙醇和正已烷分步抽提效果较好 ,对纯化方法进行了改进 ,采用先皂化后脱胶除杂质的方法 .浓缩方法采用尿素包合法 .油脂∶尿素 =1∶4的比例对该油脂浓缩较理想 ,提高了纯度和收率 ,使原油中仅含 2 0 %n 6多不饱和脂肪酸 (n 6PuFAs)提高到占总油脂的80 %以上 .

高山被孢霉GDP-L-岩藻糖合成途径中GDP-甘露糖-4,6-脱水酶的克隆、表达和功能鉴定

GDP-L-岩藻糖是糖复合物生物合成和糖类代谢的重要中间产物,作为岩藻糖转移酶的供体参与岩藻糖基化反应,具有重要的生理功能。高山被孢霉是重要的产油真菌,是唯一在分子水平上证明可合成GDP-L-岩藻糖的真菌。GDP-L-岩藻糖从头合成途径中的GDP-甘露糖-4,6-脱水酶(GMD)能催化GDP-D-甘露糖合成GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖。对高山被孢霉中的GMD基因进行克隆、表达和功能鉴定,可进一步阐明GDP-L-岩藻糖体内代谢的分子生物机制。首先对GMD序列进行分析,并以p ET28a+质粒为骨架构建了GMD的表达载体,然后转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达。进一步利用Ni金属螯合层析纯化目的蛋白,采用液相色谱-质谱法分析酶反应产物,表明纯化蛋白具有GMD活性。最后对高山被孢霉进行发酵培养,发现GDP-L-岩藻糖产量在氮源耗尽后较高,可达0.10 mg/g。同时GMD的转录水平在氮源耗尽后发生了明显的上调,表明GMD在氮源耗尽后对高山被孢霉体内GDP-L-岩藻糖的合成具有重要作用。这为进一步利用高山被孢霉发酵生产GDP-L-岩藻糖和酶法转化生产GDP-L-岩藻糖奠定了理论基础。

高山被孢霉发酵生产多不饱和脂肪酸的初步研究

高山被孢霉具有很强的脂肪合成能力,并可积累多种多不饱和脂肪酸,为进一步提高高山被孢霉多不饱和脂肪酸产量,对碳源、氮源等对高山被孢霉菌体生长和多不饱和脂肪酸(PUFA)生产的影响进行分析。研究结果表明:甘油可以作为葡萄糖的替代物用于高山被孢霉工业化发酵生产多不饱和脂肪酸;当脱脂豆粉与硝酸钾的比例为2∶1时,此时菌体形态最利于脂肪酸生产,脂肪酸和花生四烯酸的产量分别为11.20g/L和5.89g/L,花生四烯酸的产量提高了4.0倍。

调节己糖磷酸途径提高被孢霉花生四烯酸产量

研究了己糖单磷酸途径在被孢霉生产花生四烯酸中的作用 .对被孢霉中己糖单磷酸途径的关键酶———葡萄糖 6 磷酸脱氢酶 (G6PDH)活性的变化与生物量、油脂和花生四烯酸合成的关系进行了分析 ,结果表明在被孢霉发酵生产花生四烯酸的过程中 ,G6PDH活性的变化与生物量、总油脂产量、花生四烯酸含量及产量成正相关 .利用 0 .8g/L谷氨酸对G6PDH进行正调节 ,可进一步提高被孢霉生物量、总油脂产量、花生四烯酸含量及产量 .