镉对肝细胞中PPP2R1A启动子区甲基化及其转录水平的影响

目的：分析镉染毒处理肝细胞中蛋白磷酸酶2A（ PP2A）-Aα支架亚基基因PPP2R1A启动子区甲基化状态及其转录水平的改变。方法采用永生化人正常肝L02细胞及肝细胞癌HepG2细胞为研究对象，对其进行以下分组和处理：①低、中和高剂量氯化镉（ CdCl2）处理组，分别予浓度为20.0、40.0和60.0 μmol/L CdCl2处理24 h；②低、中和高剂量5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-Aza-dC）处理组，分别予浓度为2.5、5.0和10.0 μmol/L 5-Aza-dC处理48 h；③5-Aza-dC组予浓度为5.0 μmol/L的5-Aza-dC处理48 h，CdCl2组予浓度为40.0 μmol/L 的 CdCl2处理24 h，（5-Aza-dC＋CdCl2）组予浓度为5.0 μmol/L的5-Aza-dC预处理48 h后再予浓度为40.0 μmol/L CdCl2处理24 h；④ CdCl2处理组予浓度为40.0 μmol/L CdCl2处理24 h。上述4种分组均设对照组，予等体积生理氯化钠溶液或二甲基亚砜处理。经①~③处理后的细胞采用实时荧光定量聚合酶链反应（ PCR）检测PPP2R1A、金属硫蛋白1B（MT1B）和DNA甲基转移酶3A（DNMT3A）的mRNA转录水平（以对照组水平为1.00）。经④处理后的细胞采用亚硫酸氢盐修饰后PCR扩增PPP2R1A启动子区克隆测序检测CpG岛的甲基化情况。结果 L02细胞和HepG2细胞中，不同剂量CdCl2处理组PPP2R1A mRNA转录水平随镉处理剂量增高呈剂量依赖性下降（ P〈0.05）；不同剂量5-Aza-dC处理组PPP2R1A mRNA转录水平随5-Aza-dC处理剂量增加呈剂量依赖性升高（P〈0.05）。2种细胞中，分别与对照组和5-Aza-dC处理组比较，CdCl2处理组和（5-Aza-dC＋CdCl2）处理组PPP2R1A mRNA转录水平均下降（P〈0.05），MT1B和DNMT3A的mRNA转录水平均升高（P〈0.05）；与CdCl2处理组比较，（5-Aza-dC＋CdCl2）处理组PPP2R1A mRNA转录水平均升高（P〈0.05），MT1B和DNMT3A的mRNA转录水平均下降（P〈0.05）。甲基化测序结果显示，L02细胞 CdCl2处理组 PPP2R1A 启动子区甲基化率高于对照组（6.35％ vs 2.31％，P 〈0.01）， HepG2细胞CdCl2处理组PPP2R1A启动子区甲基化率与对照组比较，差异无统计学意义（5.19％ vs 3.85％，P＆gt;0.05）。结论外源化学物CdCl2可诱导肝细胞中PPP2R1A转录水平降低，可能与镉能够引起目的基因启动子区甲基化状态改变有关，提示PP2A亚基基因的表观遗传学调控可影响镉诱导的肝细胞功能。