结核病Mtb8.4/hIL-12嵌合基因疫苗免疫保护效果研究

目的研究Mtb8.4/hIL-12嵌合基因疫苗的免疫原性及对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。方法将雌性C57BL/6N小鼠40只,随机分为5组,即Mtb8.4/hIL-12嵌合基因、Mtb8.4基因疫苗组、BCG组、空载体组和PBS组。小鼠脾细胞培养上清液检测细胞因子水平;并按效靶比例分别为100∶1、50∶1、10∶1进行细胞毒性T细胞(CTL)杀伤检测。用结核杆菌H37Rv强毒株静脉攻击小鼠,计数肺和脾组织中的结核杆菌菌落数,对小鼠部分肺和脾组织作病理切片,HE染色观察组织病变程度,Z-N染色查抗酸杆菌,观察该疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。结果Mtb8.4/hIL-12嵌合基因疫苗对小鼠结核杆菌感染有一定的免疫保护效果,能够诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,细胞因子IFN-γ和IL-2分泌增加,IL-4分泌减少,特异性CTL活性增加;使小鼠肺和脾组织中的结核杆菌菌落数较空载体组显著减少,组织病变明显减轻,其效果优于卡介苗(BCG)组和Mtb8.4基因疫苗组。结论hIL-12与Mtb8.4构建成嵌合基因疫苗后,使Mtb8.4基因疫苗的免疫效力得到很大提高。

结核分枝杆菌Mtb8.4基因疫苗与人白细胞介素12表达质粒联合免疫的细胞免疫应答观察

目的观察结核分枝杆菌Mtb8.4基因疫苗与人白细胞介素12(hIL-12)联合免疫小鼠所诱导的细胞免疫应答。方法15只C57BL/6N小鼠随机分为Mtb8.4基因疫苗+hIL-12质粒组(联合免疫组)、Mtb8.4基因疫苗组、卡介苗(BCG)组、空载体组和PBS组,基因疫苗、空载体和PBS经肌内注射法免疫各组小鼠,每隔3周免疫1次,共免疫3次,BCG组经尾部皮下注射1×106CFUBCG免疫1次。ELISA法检测小鼠脾细胞培养上清中细胞因子水平;乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测免疫小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性。结果联合免疫组能诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,免疫小鼠脾细胞培养上清液IFN-γ和IL-2水平(分别为1493.340±8.128pg/ml、747.489±48.676pg/ml)显著高于Mtb8.4基因疫苗组,与BCG组相当,IL-4分泌减少,特异性CTL杀伤活性增强。结论hIL-12表达质粒能够增强Mtb8.4基因疫苗所诱导的细胞免疫应答。

Mtb8.4/hIL12嵌合基因疫苗免疫原性

目的:构建克隆结核分枝杆菌Mtb8.4/hIL12嵌合基因疫苗,并在COS7细胞中表达,研究该疫苗的免疫原性。方法:克隆Mtb8.4/hIL12嵌合基因,并导入真核表达载体pCIneo中,构建pCIneoMtb8.4/hIL12重组真核质粒。用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列测定等鉴定后,转染COS7细胞,用RTPCR和Westernblot鉴定Mtb8.4/hIL12嵌合基因在转录水平的表达。用Mtb8.4/hIL12嵌合基因疫苗免疫C57BL/6N小鼠,收集脾细胞培养上清检测细胞因子的水平,并用乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定细胞毒性T细胞(CTL)的杀伤作用。结果:pCIneoMtb8.4/hIL12重组质粒构建成功。以其转染COS7细胞后,Mtb8.4/hIL12嵌合基因在转录水平获得表达。Mtb8.4/hIL12嵌合基因疫苗能诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,IFNγ和IL2的分泌增加,IL4的分泌减少,特异性CTL的杀伤活性增强。结论:成功地构建pCIneoMtb8.4/hIL12重组质粒,并在COS7细胞中表达。构建的Mtb8.4/hIL12基因疫苗具有较强的免疫原性,可明显诱导CTL的杀伤活性。

人白细胞介素12表达质粒与Mtb8.4基因疫苗联合免疫增强对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果

本课题旨在研究结核分枝杆菌Mtb8.4基因疫苗与人白细胞介素12(hIL-12)联合免疫小鼠所诱导的细胞免疫应答及对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果.40只C57BL/6N小鼠随机分为Mtb8.4基因疫苗+hIL-12质粒组(联合免疫组)、Mtb8.4基因疫苗组、卡介苗(BCG)组、空载体组和PBS组,基因疫苗、空载体和PBS,经肌内注射法免疫各组小鼠,每隔3周免疫1次,共免疫3次.BCG组经尾部皮下注射1×106CFUBCG免疫1次.免疫4周后,每组处死3只小鼠,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测脾细胞培养上清中细胞因子水平;乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测细胞毒性T细胞(CTL)杀伤活性.每组其余5只小鼠用结核杆菌H37Rv强毒株经尾静脉攻击,4周后,计数肺和脾组织中的结核杆菌菌落数,对小鼠部分肺和脾组织作病理切片,HE染色观察组织病变程度,Z-N染色查抗酸杆菌,观察该疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果.结果显示,联合免疫组能诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,免疫小鼠脾细胞培养上清液IFN-γ和IL-2水平(分别为1493±8pg/ml、748±49pg/ml),显著高于Mtb8.4基因疫苗组,与BCG组相当,IL-4分泌减少,特异性CTL杀伤活性增强,对小鼠结核杆菌感染有较好的免疫保护效果,使小鼠肺和脾组织中的结核杆菌菌落数显著减少,组织病变明显减轻,其效果与卡介苗(BCG)组相当,优于Mtb8.4基因疫苗组.表明hIL-12表达质粒与Mtb8.4基因疫苗联合免疫后,能够增强Mtb8.4基因疫苗所诱导的细胞免疫应答,使Mtb8.4基因疫苗的免疫效力得到很大提高.

结核分枝杆菌mtb8.4/hIL12嵌合基因的克隆及真核表达质粒的构建

目的 :克隆结核分枝杆菌mtb8.4 /hIL12嵌合基因 ,构建其真核表达质粒 ,并进行鉴定。方法 :采用基因工程技术 ,首先以 pcDNA 3.1(+) -mtb 8.4为模板 ,经聚合酶链反应 (PCR)扩增出mtb 8.4 -linker基因 ,与pCI-neo载体进行连接重组 ,构建成pCI-neo -mtb 8.4 -linker(pML)重组质粒 ,然后以pORF -hIL12质粒为模板 ,经PCR扩增出hIL - 12基因 ,将hIL -12基因与pML质粒进行连接重组 ,构建成mtb 8.4 /hIL12嵌合基因真核表达质粒 ,用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列测定等多种分子生物学方法进行鉴定。结果 :mtb 8.4 /hIL12嵌合基因重组真核表达质粒经证实构建成功。结论 :mtb 8.4 /hIL12嵌合基因重组真核表达质粒的成功构建 ,为进一步研究其免疫保护效果及制备结核病mtb 8.4

结核菌Mtb8.4基因疫苗对结核杆菌感染小鼠的免疫保护效果研究

为研究Mtb8.4基因疫苗的免疫原性及对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果,将雌性C57BL/6N小鼠32只,随机分为4组,即Mtb8.4基因疫苗组、BCG组、pcDNA3.1(+)组和PBS组。小鼠脾细胞培养上清检测细胞因子水平;并按效靶比例分别为100∶1、50∶1、10∶1进行CTL杀伤活性检测。用结核杆菌H37Rv强毒株静脉攻击小鼠,计数肺和脾组织中的结核杆菌菌落数,对小鼠部分肺和脾组织作病理切片,HE染色观察组织病变程度,Z-N染色查抗酸杆菌,观察该疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。结果表明,Mtb8.4基因疫苗对小鼠结核杆菌感染有一定的免疫保护效果,能够诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,细胞因子IFN-γ和IL-2分泌增加,IL-4分泌减少,特异性CTL活性增加;使小鼠肺和脾组织中的结核杆菌菌落数较空载体组显著减少,组织病变明显减轻。

结核分枝杆菌新抗原Mtb8.4基因的克隆与真核表达

目的克隆结核杆菌新抗原Mtb8.4基因,导入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建成重组质粒pcDNA3.1(+)-Mtb8.4,并在真核细胞中进行表达。方法提取人结核杆菌H37Rv株的基因组作为模板,进行PCR扩增,获得Mtb8.4目的基因后,与pcDNA3.1(+)载体进行连接重组,用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列分析等多种方法进行鉴定;重组质粒转染COS-7细胞48h后,用RT-PCR方法鉴定Mtb8.4在转录水平的表达情况。结果pcDNA3.1(+)-Mtb8.4真核表达载体构建成功;转染COS-7细胞后,Mtb8.4在转录水平成功表达。结论pcDNA3.1(+)-Mtb8.4真核表达质粒的构建成功以及Mtb8.4在COS-7细胞中的成功表达,为进一步研究该真核表达质粒的免疫保护效果及制备结核病pcDNA3.1(+)-Mtb8.4DNA疫苗奠定了基础。

人IL-12表达质粒联合含信号肽Mtb8.4基因疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果

目的研究结核分枝杆菌含信号肽Mtb8.4(MS)基因疫苗与人白细胞介素12(hIL-12)联合免疫小鼠后,诱导的细胞免疫应答及对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。方法将40只C57BL/6N小鼠随机分为联合免疫组(MS基因疫苗+hIL-12组)、MS基因疫苗组、卡介苗(BCG)组、空载体组和PBS组。将基因疫苗、空载体和PBS,经肌内注射免疫各组小鼠,每隔3周免疫1次,共免疫3次;BCG组经尾部皮下注射1×106CFU BCG免疫1次。采用ELISA法检测小鼠脾细胞培养上清中细胞因子的水平;用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测免疫小鼠细胞毒性T细胞的杀伤活性。用结核杆菌强毒株H37Rv静脉攻击小鼠后,计数肺和脾组织中结核杆菌的菌落数。对小鼠的部分肺和脾组织作病理切片,经HE染色观察组织病变的程度,经ZN染色检查抗酸杆菌,观察该疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。结果联合免疫组能诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,免疫小鼠脾细胞培养上清液中IFN-γ和IL-2的水平,与BCG组相当,显著高于MS基因疫苗组,IL-4分泌减少,特异性CTL的杀伤活性增强,对小鼠结核杆菌感染有较好的免疫保护效果。表现为小鼠肺和脾组织中结核杆菌的菌落数显著减少,组织病变明显减轻,其效果与卡介苗(BCG)组相当,但优于MS基因疫苗组。结论以hIL-12表达质粒与MS基因疫苗联合免疫后,能显著增强MS基因疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。

一种新的分枝杆菌抗原Mtb8.4

Mtb8.4是最近从结核杆菌培养滤液中纯化分离出的一种低分子蛋白抗原,具有很强的细胞免疫活性,本文综述了Mtb8.4在结构、细菌分布、生物学活性及用途等方面的研究进展。

结核病Mtb8.4基因疫苗构建、表达及诱导的细胞免疫应答

目的制备结核病Mtb8.4基因疫苗,并研究其免疫原性。方法克隆结核杆菌新抗原Mtb8.4基因,导入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组质粒pcDNA3.1(+)Mtb8.4,转染COS7细胞后,用RTPCR检测Mtb8.4基因在细胞内正确表达。将Mtb8.4基因疫苗肌肉注射免疫C57BL/6N小鼠,第3次DNA免疫后4周,处死小鼠,制备免疫小鼠脾细胞,脾细胞培养上清检测细胞因子水平;并按效、靶比例分别为100∶1、50∶1、10∶1进行CTL杀伤检测。结果Mtb8.4基因疫苗组免疫小鼠脾细胞培养上清中γ干扰素(IFNγ)和白细胞介素2(IL2)含量分别为787.317±45.586pg/ml和319.953±57.978pg/ml,BCG组分别为1486.540±39.600pg/ml和767.043±50.269pg/ml,BCG组IL4的含量为90.580±10.998pg/ml,明显高于其他各组(P<0.01)。效靶比为100∶1、50∶1、10∶1时,Mtb8.4基因疫苗组的CTL活性分别为55.3%、35.7%、9.2%,BCG组分别为28.9%、21.4%、9.8%。Mtb8.4基因疫苗主要使抗原特异性Th1型细胞免疫应答增强,细胞因子IFNγ和IL2分泌增加,IL4分泌减少,CTL活性增加;而BCG使IFNγ、IL2和IL4分泌均增加。结论结核病Mtb8.4基因疫苗能诱导较强的Th1型细胞免疫应答,可作为结核病的候选疫苗。

枯草芽胞杆菌表达牛分支杆菌Mtb8.4抗原摇瓶发酵条件优化

为了建立枯草芽胞杆菌摇瓶发酵表达牛分支杆菌Mtb8.4抗原的制备方法,对已构建的含有pNC-HisE-Mtb8.4质粒的分泌表达载体,在枯草杆菌表达系统中进行分泌性表达,采用单因素影响试验方法,在摇瓶水平上进行了表达产量优化。结果表明,各因素的最佳条件是2SY培养基、接种浓度为6%、18h最佳种子阶段,在33℃的培养温度下振荡培养48h,目的蛋白的表达量能够达到750mg/L。该表达条件的确立,为后期生产工艺放大奠定了基础。

结核杆菌Mtb8.4/hIL12嵌合基因真核表达质粒的构建与表达

目的 克隆结核分枝杆菌Mtb8.4 /hIL12嵌合基因 ,导入真核表达载体pCI neo ,并在真核细胞中进行表达。方法 采用基因工程技术 ,首先以 pcDNA3.1(+) -Mtb8.4为模板 ,经聚合酶链反应 (PCR)扩增出Mtb8.4 linker基因 ,与 pCI neo载体进行连接重组 ,构建成pCI neo Mtb8.4 linker(pML)重组质粒 ,然后以 pORF hIL12质粒为模板 ,经PCR扩增出hIL 12基因 ,将hIL 12基因与 pML质粒进行连接重组 ,构建成Mtb8.4 /hIL12嵌合基因真核表达质粒 ,用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列测定等多种分子生物学方法进行鉴定 ;重组嵌合质粒转染COS - 7细胞后 ,用RT PCR方法鉴定Mtb8.4 /hIL12嵌合基因在转录水平的表达情况。结果 Mtb8.4 /hIL12嵌合基因重组真核表达质粒经证实构建成功 ;转染COS - 7细胞后 ,Mtb8.4 /hIL12嵌合基因在转录水平成功表达。结论 Mtb8.4 /hIL12嵌合基因重组真核表达质粒的成功构建及在COS- 7细胞中的成功表达 ,为进一步研究其免疫保护效果及制备结核病Mtb8.4

结核分支杆菌Mtb8.4真核、原核表达质粒的构建与表达

低分子质量蛋白抗原Mtb8.4是一种非常重要的结核分支杆菌抗原,为了研制结核病核酸疫苗和进行结核病的诊断,分别将其构建到原核和真核载体中进行表达。以结核分支杆菌标准菌株H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增目的基因Mtb8.4,扩增产物酶切后分别克隆到真核表达载体pJW4303和原核表达载体pGEX-4T-1中,构成重组真核表达载体pJW-Mtb8.4和重组原核表达载体pGEX-Mtb8.4,用限制性内切酶消化,PCR扩增及DNA序列分析等多种方法鉴定;并将正确构建的原核表达载体转入E.coliBL21(DE3)plysS中,IPTG诱导表达。结果表明,重组真核表达载体pJW-Mtb8.4和重组原核表达载体pGEX-Mtb8.4构建成功。构建的真核重组质粒pJW-Mtb8.4即可作为结核病DNA疫苗。原核表达载体pGEX-Mtb8.4在BL21(DE3)plysS中成功表达,将表达蛋白进行纯化,作为保护性结核分支杆菌抗原以便检测DNA疫苗的免疫效果。

结核分枝杆菌新抗原Mtb8.4基因的克隆及真核表达载体的构建

目的 克隆结核杆菌新抗原Mtb8.4基因 ,并构建真核表达载体pcDNA 3 .1( +) mtb8.4。方法 提取人结核杆菌H3 7Rv株的基因组作为模板 ,进行PCR扩增 ,获得mtb8.4目的基因后 ,与pcDNA 3 .1( +)载体进行连接重组。结果 pcDNA 3 .1( +) mtb8.4真核表达载体构建完成后 ,用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列分析等多种方法进行鉴定 ,证实其构建成功。结论 pcDNA 3 .1( +) mtb8.4真核表达质粒的成功构建 ,为进一步研究该真核表达质粒的免疫保护效果及制备结核病pcDNA 3 .1( +) mtb8.4DNA疫苗奠定了基础。

牛分支杆菌ESAT-6/Ag85B/Mtb8.4基因与牛IL-2基因融合表达

本研究拟制备牛IL-2与牛分支杆菌ESAT-6、Ag85B和Mtb8.4基因的融合蛋白。从患结核病鹿的肺组织中分离牛分支杆菌并提取基因组DNA,PCR扩增牛分支杆菌ESAT-6、Ag85B和Mtb8.4基因;提取牛淋巴细胞,经总RNA提取、RT-PCR得到了IL-2基因片段。经测序鉴定后,将4个目的片段重组,构建原核表达载体,并对表达的融合蛋白进行鉴定。克隆出了牛IL-2,以及牛分支杆菌ESAT-6、Ag85B和Mtb8.4基因;构建了原核表达载体pME290-SDCZ,并表达出了融合蛋白;Western印迹结果证实该重组蛋白能与抗牛分支杆菌多克隆抗体发生特异免疫结合反应。制备了牛IL-2与牛分支杆菌ESAT-6、Ag85B和Mtb8.4融合蛋白,本研究为下一步研制重组牛结核亚单位疫苗奠定了基础。

结核分枝杆菌Mtb8.4-Hspx和Hspx-Mtb8.4重组基因克隆及表达

目的构建结核分枝杆菌去标签重组蛋白Mtb8.4-Hspx(MH)和Hspx-Mtb8.4(HM)原核表达载体,并在大肠埃希菌株BL21(DE3)中表达。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增Mtb8.4、Hspx基因,产物经纯化后与载体PET30a连接、转化及测序鉴定,构建原核重组表达质粒PET30a-Mtb8.4和PET30a-Hspx。抽提重组质粒,产物经纯化后与目的基因Hspx、Mtb8.4连接,转化及测序鉴定,构建重组目的基因质粒PET30a-Mtb8.4-Hspx(PET30a-MH)和PET30a-Hspx-Mtb8.4(PET30a-HM)载体,转化大肠埃希菌BL21,以IPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测表达产物。结果 SDS-PAGE蛋白电泳验证去标签MH和HM融合蛋白分子质量单位为28 ku,与预期值相符。结论本研究成功表达去标签结核杆菌重组蛋白MH和HM,为结核亚单位疫苗免疫原性和临床前研究奠定了基础。

一种结核杆菌融合抗原的克隆表达及活性测定

目的进一步分析优化结核杆菌抗原优势表位,获得高特异性融合抗原,以满足研制结核病检测试剂的需要。方法用分子生物学软件分析结核杆菌四种抗原MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtb16.3的优势表位后,分别插入到pBVIL1载体中,构建表达质粒,并利用pBVIL1载体特点,将其基因连接后,进行融合表达,经纯化获得抗原,用间接ELISA法测其活性。结果各抗原优势肽段及融合抗原均获得了高效表达,融合抗原的特异性和灵敏性均高于各单一肽段。结论此融合抗原可用于研制结核病的诊断试剂。

结核杆菌含信号肽的Mtb8·4/hIL12嵌合基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的:克隆含信号肽的Mtb8·4(MS)/hIL12嵌合基因,构建其真核表达质粒,并进行鉴定。方法:以pcDNA3·1(+)-含信号肽的Mtb8·4(pMS)质粒为模板,经聚合酶链反应(PCR)扩增出MS-linker基因,与pCI-neo载体进行连接重组,构建成pCI-neo-MS-linker(pMSL)重组质粒,然后以pORF-hIL12质粒为模板,经PCR扩增出hIL12基因,将hIL12基因与pMSL质粒进行连接重组,构建成MS/hIL12嵌合基因真核表达质粒,用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列测定等方法进行鉴定。结果:MS/hIL12嵌合基因重组真核表达质粒经证实构建成功。结论:MS/hIL12嵌合基因重组真核表达质粒的成功构建,为进一步研究其免疫保护效果及制备结核病MS/hIL12嵌合基因疫苗奠定了基础。