Mucin 16蛋白的表达纯化及单克隆抗体的制备与鉴定

目的:在原核生物中表达带有His标签的mucin 16N端重组蛋白(简称为His-mucin 16N),制备抗mucin 16的单克隆抗体(mAb)。方法:将mucin 16基因片段插入原核表达载体pET-32,在大肠杆菌中表达重组蛋白,用亲和纯化方法纯化后免疫BALB/c小鼠,并进行细胞融合。筛选可稳定分泌抗mucin 16抗体的阳性单克隆杂交瘤细胞株,用Westernblot、ELISA、免疫荧光和免疫组化等方法分析和鉴定抗mucin16的mAb。结果:表达并纯化了His-mucin 16N蛋白;筛选出几株可稳定分泌特异性抗人mucin 16 mAb的细胞株;挑选出效价高、特异性好的1株进行纯化。获得的抗mucin 16 mAb,可用于Western blot、ELISA、免疫组化、免疫荧光等检测,并鉴定该抗体亚型为IgG1。通过上述免疫学实验,分析了在不同肿瘤细胞中mucin 16的表达情况。结论:在原核生物中成功表达和纯化带His标签的mucin 16N重组蛋白,制备出具有高特异性的抗mucin16的mAb。

miR-4645-5p通过靶向MUC16调控食管癌细胞的恶性生物学行为

目的 探讨微小RNA(miR)-4645-5p靶向黏蛋白16(MUC16)对食管癌细胞增殖、侵袭、上皮间充质转化的影响及其分子机制。方法 通过TCGA数据库在线分析miR-4645-5p在食管癌组织中的表达。利用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)分析食管癌细胞系中miR-4645-5p的表达水平。通过脂质体转染技术将miR-4645-5p模拟物和阴性对照模拟物转染KYSE-30细胞,作为miR-4645-5p组和对照模拟物组。分别采用CCK-8法、划痕实验、Transwell实验分析转染KYSE-30细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力。通过生物信息学网站预测miR-4645-5p的靶基因,双荧光素酶报告基因实验检测miR-4645-5p对靶基因的结合。采用qPCR检测MUC16 mRNA的表达水平,Western blotting检测MUC16、转录因子-1(ZEB-1)、闭锁小带蛋白-1(ZO-1)、紧密连接蛋白-1(Claudin-1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白的表达水平。结果 食管癌组织中miR-4645-5p表达水平低于癌旁组织(P<0.01)。与HET-1A比较,食管癌细胞系中miR-4645-5p呈低表达(P<0.05)。miR-4645-5p过表达后,KYSE-30细胞增殖能力降低(P<0.05),迁移能力降低(P<0.01),侵袭能力明显降低(P<0.01)。miR-4645-5p靶向负调控MUC16 mRNA的表达(P<0.01)。miR-4645-5p过表达后,MUC16、ZEB-1、α-SMA蛋白表达均下调,ZO-1、Claudin-1蛋白表达均上调。结论 miR-4645-5p通过靶向MUC16调控食管癌KYSE-30细胞的恶性生物学行为。

ERO1L、MUC16在非小细胞肺癌组织中的表达及临床价值

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)中内质网氧化还原酶1α(ERO1A)、细胞表面相关黏蛋白16(MUC16)表达及临床价值。方法以2018年2月至2019年2月于该院就诊的94例NSCLC患者为研究对象。应用荧光定量PCR及免疫组织化学检测癌组织及癌旁组织中ERO1A和MUC16 mRNA及蛋白表达,分析ERO1A、MUC16 mRNA表达与临床病理特征的关系。采用Kaplan-Meier生存曲线分析ERO1A、MUC16 mRNA表达与NSCLC患者预后的关系,单因素及多因素COX回归分析影响NSCLC患者生存预后的因素。结果NSCLC癌组织中ERO1A、MUC16 mRNA表达水平均明显高于癌旁组织,差异有统计学意义(t=34.472、22.528,均P<0.05)。Pearson相关性分析结果显示,NSCLC中ERO1A与MUC16 mRNA表达呈正相关(r=0.610,P<0.001)。免疫组织化学法检测结果显示,ERO1A和MUC16蛋白均位于细胞膜和细胞质,NSCLC癌组织中ERO1A和MUC16蛋白阳性率明显高于癌旁组织,差异有统计学意义(χ^(2)=143.323、153.741,均P<0.001)。ERO1A mRNA表达与肿瘤分期、淋巴结转移有关(P<0.05),MUC16 mRNA表达与肿瘤分期、病理分级及淋巴结转移有关(P<0.05)。ERO1A mRNA高表达组患者累积生存明显低于低表达组(Log-rankχ^(2)=8.776,P=0.003),MUC16 mRNA高表达组患者累积生存明显低于低表达组(Log-rankχ^(2)=8.003,P=0.005)。肿瘤分期Ⅲ期、伴淋巴结转移、ERO1A及MUC16 mRNA高表达影响NSCLC患者生存预后的独立危险因素。结论NSCLC癌组织中ERO1A、MUC16表达升高,是影响NSCLC患者生存预后的独立危险因素,二者表达升高与NSCLC患者不良临床病理特征及预后有关。

CE-SELEX法筛选Mucin16胞外域的核酸适配体

目的 CA125与胃癌的腹腔转移及不良预后密切相关,文中旨在针对CA125所属糖蛋白Mucin16的胞外域,筛选针对其的单链DNA核酸适配体。方法利用毛细管电泳法筛选Mucin16胞外域-合成多肽的适配体,同时利用毛细管电泳定量测定每轮筛选的Kd值及所筛得的适配体与多肽的亲和力,激光共聚焦成像法对所筛得的适配体靶向癌细胞进行评价。结果经过5轮筛选,测序分析及亲和力测定,成功获得1条针对Mucin16胞外域多肽的最优单链DNA核酸适配体,Kd值达122.7 nm,并且在表达Mucin16的人卵巢癌细胞株的细胞膜上清晰可见绿色荧光信号,证实所筛适配体能够结合Mucin16的细胞膜胞外域。结论利用毛细管电泳法成功筛选出针对Mucin16胞外域的核酸适配体,在为胃癌腹腔转移的诊疗中提供了新的靶向分子。

HPV16相关宫颈癌组织中MUC16和E6表达的关系

目的:探讨人乳头瘤病毒(HPV)16相关宫颈癌组织中粘蛋白抗原16(MUC16)与E6表达的关系。方法:以HPV16 E6阳性和阴性的宫颈癌细胞系和宫颈鳞状细胞癌(简称鳞癌)组织(184例)为研究对象,采用Western blot和免疫组化方法检测HPV16 E6和MUC16的表达。结果:Western blot结果显示:C-33A细胞中HPV16 E6无表达,Ca Ski细胞和Si Ha细胞中可见HPV16 E6表达;C-33A细胞中MUC16的表达低于Ca Ski细胞和Si Ha细胞(P<0.05),Ca Ski细胞和Si Ha细胞中MUC16的表达差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组化结果显示:HPV16E6阳性的宫颈鳞癌组织中MUC16的表达高于HPV16 E6阴性的宫颈鳞癌组织(χ2=43.670,P<0.001)。结论:宫颈癌细胞系和鳞癌组织中MUC16与E6表达可能有关。

MUC16对骨肉瘤细胞增殖和侵袭能力的影响

目的探讨黏蛋白16(MUC16)对人骨肉瘤细胞系U2OS增殖和侵袭能力的影响。方法将U2OS细胞按转染序列的不同分为sh-MUC16组(转染MUC16干扰序列)、sh-Control组(转染阴性对照序列)和空白组(不处理)。采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测各组MUC16 mRNA表达,噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性,Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力,免疫印迹法检测细胞中MUC16、上皮型钙黏蛋白(E-Cad)和神经型钙黏蛋白(N-Cad)表达。结果sh-MUC16组MUC16 mRNA相对表达量显著低于sh-Control组和空白组(P<0.05),sh-Control组与空白组之间差异无统计学意义(P>0.05)。sh-MUC16组培养24、48、72和96 h时细胞增殖活性低于sh-Control组和空白组(P<0.05)。sh-MUC16组迁移和侵袭细胞数均低于sh-Control组和空白组(P<0.05)。sh-MUC16组MUC16和N-Cad相对表达量均低于sh-Control组和空白组(P<0.05),E-Cad相对表达量高于sh-Control组和空白组(P<0.05)。结论沉默U2OS细胞中MUC16基因表达可抑制细胞增殖、迁移和侵袭,其机制可能与抑制上皮-间质转化有关。

黏蛋白16在神经胶质瘤组织中表达及意义

目的检测黏蛋白16(MUC16)在神经胶质瘤组织中的表达情况,探讨下调MUC16基因表达对U87细胞增殖、迁移和侵袭力的影响。方法选取2013年5月—2019年5月在焦作市人民医院行手术治疗的神经胶质瘤患者86例及因颅脑外伤行手术治疗的患者45例。免疫组织化学法检测神经胶质瘤和正常脑组织中MUC16蛋白表达水平,培养U87细胞并分为MUC16干扰组、阴性对照组和空白组,分别利用实时荧光定量PCR、MTT法、划痕实验和Transwell法检测U87细胞中MUC16表达情况,以及各组细胞增殖、迁移和侵袭能力。结果MUC16蛋白在神经胶质瘤患者中阳性表达率73.26%,正常脑组织为26.67%,两者比较差异有统计学意义(P<0.001);MUC16蛋白在不同WHO分级阳性表达率比较,差异有统计学意义(P<0.05);MUC16干扰组MUC16 mRNA相对表达量,24、48、72和96 h时吸光度(A)值、24和48 h时划痕愈合率、侵袭细胞数均低于阴性对照组和空白组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论神经胶质瘤组织中MUC16呈高表达,且与WHO分级呈正相关,下调U87细胞中MUC16基因表达可抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力。

黏蛋白16基因通过磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路调节胆囊癌细胞活力和迁移

目的探讨黏蛋白16基因(MUC16)是否通过磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路调节胆囊癌细胞(GBC-SD)活力和迁移。方法过表达MUC16后,通过Real-time PCR筛选相关基质金属蛋白酶(MMP)家族的蛋白质。其次,过表达MUC16、敲低MUC16和PI3K/Akt通路抑制剂BKM120处理后,通过免疫印迹法检测PI3K/Akt通路和MMP-9的蛋白水平。最后,过表达MUC16或敲低MUC16,通过细胞计数试剂盒8(CCK-8)和刮伤实验检测GBC-SD的活力和迁移情况。结果过表达MUC16后,MMP-9 mRNA的相对表达量显著升高(P<0.05)。过表达MUC16后, MMP-9、p-Akt、PI3K的蛋白水平明显升高(P<0.05),但是PI3K抑制剂BKM120可以避免这现象。而敲低MUC16后,发现MMP-9、p-Akt、PI3K的蛋白水平明显降低(P<0.05)。过表达MUC16后,GBC-SD的细胞活力和迁移能力明显增高(P<0.05),而敲低了MUC16后,GBC-SD的细胞活力和迁移能力明显降低(P<0.05)。另外,敲低MMP-9后,GBC-SD的细胞活力和迁移能力也明显降低(P<0.05)。但是,在过表达MUC16的同时敲低MMP-9,发现GBC-SD的细胞活力和迁移能力与对照组相比差异无显著性(P>0.05)。结论 MUC16激活PI3K/Akt通路促进MMP-9的蛋白表达,进而提升胆囊癌细胞GBC-SD的细胞活力和迁移能力。

血清CC16、Tim-3对老年多重耐药菌血流感染预后的预测价值分析

目的探究血清Clara细胞蛋白16(CC16)、T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(Tim-3)对老年多重耐药菌血流感染患者预后的预测价值。方法本研究通过选取2020年1月-2022年12月在本院治疗的老年多重耐药菌血流感染患者(80例)作为血流感染组,取同期在本院体检健康者(80例)作对照组,比较两组血清CC16、Tim-3水平;根据患者的预后情况将其分为生存组和死亡组,比较两组一般资料以及血清CC16、Tim-3水平。ROC分析血清CC16、Tim-3水平对血流感染患者预后的预测价值。Logistic分析影响血流感染患者预后的因素。结果血流感染组血清CC16水平比对照组低,Tim-3水平比对照组高(P<0.05)。死亡组血清CC16水平比生存组低,Tim-3、白细胞计数(WBC)、C-反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)水平比生存组高(P<0.05)。血清CC16、Tim-3联合预测血流感染患者死亡的AUC为0.920(95%CI:0.856~0.984),高于其单独检测(Z=2.571、2.915,P<0.05),灵敏度77.80%,特异度85.50%。Logistic回归模型分析显示,Tim-3是影响血流感染患者死亡的危险因素,CC16是保护因素(P<0.05)。结论血清CC16、Tim-3对老年多重耐药菌血流感染患者的预后有一定的预测价值,可能是评估患者预后情况的潜在指标。