Development of microsatellite markers and their utilization in genetic diversity analysis of cultivated and wild populations of the mud carp (Cirrhina molitorella)

Microsatellite markers have been increasingly used in genetic studies on fishery species because of their high applicability in selective breeding programs. Here we reported the development of microsatellite markers and their utilization in mud carp （Cirrhina molitorella）. An （CA）15 enriched library has been constructed for mud carp, using the magnetic beads enrichment procedure. Sequence analysis of 60 randomly picked positive colonies indicate that 56 （93.3%） of the colonies contain microsatellites. Microsatellite polymorphism was assessed using 10 mud carp individuals, and 12 microsatellite loci turned out to be polymorphic. We utilized these loci to study the genetic diversity of a wild population （WM） and a cultured population （CM） of the mud carp. A total of 109 alleles were detected with an average of 9.08 alleles per locus. The mean value of the observed heterozygosity of WM and CM was 0.6361 and 0.6417, respectively, and significant decrease of genetic diversity in CM was not observed. The genetic distance between the two populations was 0.1546 and the value of Gsr was 0.0473. This showed that there existed a slight genetic differentiation between WM and CM.

硫酸铜对鲮鱼苗的急性毒性

以鲮鱼苗为对象,配制不同质量浓度硫酸铜溶液并模拟药浴过程。在7 d实验周期内,每隔24 h统计死亡鱼体数量、体长及重量,采用直接回归法计算出半致死浓度(LC_(50)),进一步求得相应的Cu^(2+)安全浓度(SC)、毒性累积程度(MAC),借助紫外分光光度法和火焰原子吸收法测定实验前后水体中Cu^(2+)的质量浓度。鲮鱼苗在硫酸铜溶液中的累计死亡率(概率单位)与Cu^(2+)质量浓度的对数呈正相关,浸泡24 h的LC_(50)和SC分别为1.4612、0.1461 mg/L,之后逐步下降,毒性累积程度曲线呈S形。水体中Cu^(2+)质量浓度在实验后相比实验前下降,硫酸铜在鲮鱼苗体内蓄积。硫酸铜对鲮鱼苗的急性毒性属于高毒性,且鲮鱼苗耐受性较差,在养殖中采用高浓度短时间药浴法最佳。

鲮Myf5基因克隆及其SNPs分析

提取新鲜鲮(Cirrhinus molitorella)肌肉总RNA,采用RT-PCR技术分段克隆鲮Myf5基因核心序列,获得1104bp的目的片段,其中开放阅读框为723bp,编码240个氨基酸。分析表明,鲮Myf5蛋白具有MRF家族基因的典型性碱性bHLH螺旋-环-螺旋(Basic helix-loop-helix,bHLH)结构。设计特异性引物扩增获得2个内含子,大小分别为1311bp和90bp。用单链构向多态性SSCP的方法分析了Myf5基因在珠江水系3个不同江段鲮中的遗传变异,分布及群体杂合性等群体遗传信息。发现其编码区非常保守,仅在外显子412位点处发生突变C→T。对该位点进行基因型分析,结果表明:珠江北江段鲮中该位点符合Hardy-Weinberg平衡,而东江和西江段种群不符合Hardy-Weinberg平衡,3个江段种群总体上符合Hardy-Weinberg平衡,并存在较大基因流。以Myf5基因该位点的多态性分析表明,3个种群未出现明显分化;通过该位点的遗传结构分析表明:3个江段种群杂合度都较高,中度信息含量(PIC)及多态信息指数,即该位点有较好的变异性及遗传多态性。3个江段种群总体上该位点在不符合Hardy-Weinberg的情况下AA>BB,并由该位点群体杂合性及中性分析表明该位点突变群体具体良好的多态性且不遵循中性选择模式,说明BB型个体受到自然选择。本研究结果表明,鲮Myf5基因的C412T与个体生长有相关性,可作为候选基因标记,用于鲮生长相关分子标记辅助育种研究。

RAPD技术鉴定3种鲮的研究

以池塘养殖的鲮（Ｃｉｒｒｈｉｎａ ｍｏｌｉｔｏｒｅｌｌａ） 、麦鲮（ Ｃ． ｍｒｉｇｏｌａ） 和野鲮（Ｌａｂｅｏ ｒｏｈｉｔａ） 各１２ 尾为材料，提取血液基因组ＤＮＡ，利用１０ ｂｐ 随机引物进行ＰＣＲ扩增，通过缩短扩增反映时间和电泳时间，快速鉴定３ 种不同的鲮鱼，建立了一套ＤＮＡ 分子水平上的快速鉴定鱼种的方法。

鲤鱼DNA对鲮鱼耐寒性能的影响

用常规显微注射法将鲤鱼总ＤＮＡ注入鲮鱼受精卵，并将受精卵培育成鱼种。以自然降温方式及人工降温方式测试并比较了实验组鲮鱼与正常鲮鱼的耐寒能力。结果表明，实验组鲮鱼的耐寒能力优于正常鲮鱼，但改善是有限的。

鲻和鲮鳃丝的扫描电镜比较观察

对鲻(Mugilcephalus)和鲮(Cirrhinamolitorella)的鳃丝表面结构进行了扫描电镜比较观察,结果表明,鲻鳃丝杆状部比鲮粗,鲻鳃小片高度比鲮低;两者鳃丝表面分泌孔洞口径和密度不同;鲻和鲮细胞外被不同,鲻细胞外被稀疏,鲮的则致密复杂;鳃小片细胞和鳃丝表皮细胞的表面形态存在差异,文章还描述了鳃丝表皮形态特异的细胞。

广东贺江水域野生鲮鱼体表寄生虫典型海弯水虱的种群动态

近年来,广东贺江暴发了由等足类寄生虫引起的严重的鱼类外寄生虫病,给当地网箱养殖和野生鱼类资源造成了严重危害。根据虫体的口器、触角、腹肢等形态学特征将其鉴定为等足目(Isopoda)、扇肢亚目(Flabellifera)、纺锤水虱科(Aegidae)、海弯水虱属(Alitropus)的典型海弯水虱(Alitropus typus)。为了弄清典型海弯水虱对贺江内野生鱼类资源的危害及其种群季节动态变化规律,作者从2006年5月份到2007年4月份,用刺网定时定点捕获野生鲮鱼(Cirrhina molitorella),检查典型海弯水虱的寄生状况。结果发现:典型海弯水虱对鲮鱼的感染率、感染强度和平均密度均从2006年5月份开始上升,至7月份达到高峰,然后逐渐下降,于次年的2月份达到最低点,从3月份开始有所回升。典型海弯水虱种群在不同月份及不同体长鲮鱼中均为聚集性分布,且聚集强度随着平均密度的增加而增加。典型海弯水虱种群在鲮鱼中的感染参数与水温呈显著的正相关,而与宿主的体长无明显的相关性。周年种群结构动态变化分析表明:典型海弯水虱1年只繁殖1次,繁殖受水温的影响,6、7月份是其繁殖高峰期。

不同蛋白水平对鲮消化酶活性的影响

以秘鲁鱼粉为饲料蛋白源,研究4种蛋白水平(20%、30%、40%、50%)的饲料对鲮(Cirrhinus molitorella)肠和肝胰腺消化酶活性的影响。结果表明:随着饲料蛋白水平的增加,肠和肝胰腺的蛋白酶比活性有所增加,其中50%组与20%组差异极显著(P<0.01),40%组与20%组差异显著(P<0.05);肠和肝胰腺的淀粉酶比活性随饲料蛋白水平的增加略有下降,50%组与20%和30%组有显著差异(P<0.05);脂肪酶比活性随饲料蛋白水平的增加也有所下降,20%组与30%组,40%组和50%差异极显著(P<0.01),其他组间差异不显著(P>0.05)。在试验前4周鲮的消化酶比活性均有所增加,第4周后增加到最大值,此后略有下降,但也基本稳定在同一个水平,表明鲮消化酶活性对饲料蛋白含量具有适应性反应。

用IGF-ⅠmRNA表达量评价鲮饲料配方效果的研究

试验以秘鲁鱼粉为饲料蛋白源,研究4种蛋白水平(21.5%、32.2%、42.5%和51.6%)的饲料对鲮(Cirrhinus molitorella)生长、消化酶活性及类胰岛素生长因子(IGF-Ⅰ)mRNA表达水平的影响。经过8周的养殖试验,不同饲料蛋白水平下,蛋白酶活性与特定生长率(SGR)成极显著的正相关性(P<0.01);鲮肝组织中IGF-ⅠmRNA的表达量与特定生长率成极显著正相关性(P<0.01);鲮肝组织IGF-ⅠmRNA的表达量与蛋白酶活性也成极显著正相关性(P<0.01)。结果表明,用鲮肝组织IGF-ⅠmRNA的表达量可以快速鉴定饲料的质量。

鲮鱼和二代混精鲮鱼低温耐受能力的差异

采用LKB循环冷却装置以程序降温方式比较鲮鱼及二代混精鲮鱼(草鱼混精鲮或多精混精鲮再用草鱼精液进行混精受精所得子代)的耐寒性能。无论是在7.0℃条件下的耐受时间,还是对低温耐受的极限,二代混精鲮鱼均优于鲮鱼,但这种改善是有限的。作者认为,混精受精法不能从根本上解决鲮鱼的不耐寒性能。应该寻求其他更有效的育种途径。

鲮鱼的微卫星位点筛选和群体遗传多样性初步分析(英文)

利用鲤科鱼类微卫星引物在鲮鱼中进行扩增,结果在24对引物中,13对引物能成功扩增,且在鲮鱼中的扩增产物表现稳定,其中11对有较高多态性,等位基因数在2—7个之间,扩增的条带符合孟德尔遗传规律。随后利用筛选的微卫星座位对鲮鱼野生和养殖群体遗传多样性进行了初步分析。分析结果显示鲮鱼野生群体的平均等位基因数5.2个;观测杂合度在0.25与0.8之间,平均观测杂合度(Ho)是0.61±0.2 ,平均期望杂合度(He)是0.8±0.09 ;群体座位平均多态信息含量(PIC)为0.72±0.1。相比之下,养殖群体的平均观测杂合度(Ho)和平均期望杂合度(He)都低于野生群体,分别是0.59±0.2、0.75±0.1。两群体间的遗传相似度为0.7774、遗传距离为0.2518。研究表明用其他鱼类分离出的微卫星引物可以快速筛选到适用于鲮鱼遗传分析的微卫星座位。

鲮微卫星引物的鉴定及其适用性检验

利用4种鲤科鱼类的14对微卫星引物对西江流域一批野生鲮进行PCR扩增。将各扩增条带进行克隆测序，发现引物MFW1、MFW2、MFW15、MFW17、Cc7、Cc11、Bgon22扩增出的产物含有微卫星重复序列。进一步对鲮的微卫星位点MFW1、MFW2、Cc7重新设计引物，并将其分别命名为Cm1、Cm2、Cm3，新引物对鲮的扩增特异性增强。采用引物Cm1、Cm2、Cm3、Cc11、MFW15、MFW17、Bgon22对西江流域一批野生鲮进行引物适用性检验。结果表明，除引物MFW15、Cc11无多态性外，其余5对引物（Cm1、Cm2、Cm3、MFW17、Bgon22）在取样群体中扩增图谱带型丰富，随引物不同，各标记在群体中检测到的等位基因数为2到16个。各微卫星座位的期望杂合度（He）及观察杂合度（Ho）范围分别为0～0．9038和0～1，平均分别为0．6881（0．1819SD）和0．7772（0．1931SD）。座位连锁分析显示Cm1与Bgon22之间存在显著性水平连锁关系（P〈0．05），其余各座位之间未检测到明显的连锁关系（P〉0．05）。研究群体的遗传多样性指数平均为0．6823，多态性水平相对较高。以上结果表明，筛选获得的7个微卫星座位适于对鲮进行遗传多样性分析。

水库鲮和罗非鱼谷胱甘肽转移酶基因表达量与水中蓝藻含量的关系

采用荧光定量的方法对不同季节广州显岗水库鲮(Cirrhinus molitorella)和尼罗罗非鱼(Oreochro-mis niloticu)肝脏中去毒酶基因谷胱甘肽转移酶GST基因的表达情况,并结合不同季节鱼类摄入蓝藻量进行研究,旨在了解鱼体中GST基因的表达量与水体中蓝藻含量的内在联系。结果表明,4月份水库蓝藻暴发,也是鲮和尼罗罗非鱼摄食产毒蓝藻量最多的月份。GST基因的表达情况是:4月份鲮GST基因表达量比其他月份低,可能与鲮对有毒蓝藻的敏感性和耐受力有关,4月份尼罗罗非鱼GSTA及GSTR2表达量最高;其他月份,鲮GSTT表达量最高,而GSTK表达量较低,尼罗罗非鱼GSTA及GSTR2表达量相对较低。结果表明鲮GSTT在去毒过程中起重要作用,但作为环境检测的生物标记,仅适用于环境中藻毒素较低的情况。尼罗罗非鱼GSTA和GSTR2的表达量与食物中的产毒蓝藻生物量多少成正比,因此,尼罗罗非鱼GSTA及GSTR2可作为环境中藻毒素的生物标记,且尼罗罗非鱼可摄入大量有毒蓝藻,通过GST基因去除有毒蓝藻毒性,可用于生物控藻,改善水质。

广东1个鲮原种群体的种质特征及遗传多样性分析

收集西江流域肇庆段的野生鲮鱼苗进行跟踪观察,记录其生长情况,测量形态参数,结果表明,该批鲮原种存在体色及生长性能等方面的分化一种体色淡黄,命名为子群体h,一种体色青,命名为子群体q;子群体h的生长性能优于子群体q。从2个子群体中各取24个个体进行RAPD分析。20条随机引物扩增共获得了179条清晰稳定的条带,其中多态性条带为82条。用popgen软件进行RAPD数据处理,结果是总群体的平均杂和度为0.1281,遗传距离为0.1232;子群体h的平均杂和度为0.1248,遗传距离为0.1151;子群体q的平均杂和度为0.1164,遗传距离为0.1010;2个子群体间的遗传距离值为0.1383。这个结果表明,该原种群体遗传多样性较高。

二硫代磷酸酯类对尼罗罗非鱼和鲮体内AChE酶活性的影响

为探明二硫代磷酸酯类对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的特异性毒性机理,以尼罗罗非鱼和土鲮(Cirrhinus molitorella)为试验对象,研究暴露在不同药物质量浓度(0.05、0.1 mg/L)和不同时间下2种鱼的生存状况以及体内乙酰胆碱酯酶(ACh E)活性的变化。结果表明:在急性毒性试验及清水恢复的整个过程中,暴露在0.05、0.1 mg/L药液中的尼罗罗非鱼和鲮的死亡率分别为100%和0;尼罗罗非鱼和鲮的脑及肝脏中的ACh E酶活性呈现出随药物暴露浓度和时间的增加而显著降低的趋势,但尼罗罗非鱼体内ACh E酶活性的下降幅度显著高于鲮(P<0.05),且呈现不可逆的趋势;在10 d清水恢复后,暴露在0.05、0.1 mg/L药液中的鲮脑中的ACh E酶活性复原度高达96.25%、79.33%。由此得出,低剂量的二硫代磷酸酯类对尼罗罗非鱼具有高毒性,而对鲮的毒害作用较小,其特异性的毒杀机制可能源于2种鱼体内ACh E酶活性对二硫代磷酸酯类敏感性的显著性差异。

鱼类低温适应机制的研究——(Ⅰ)驯化温度对草鱼和鲮鱼几种同工酶活性及酶谱的影响

采用分光光度法测呈了25℃和10℃驯养的草鱼、鲮鱼、二代混精鲮鱼及对照组混精鲮鱼的肌肉和肝脏组织中乳酸脱氨酶(LDH)、6-磷酸葡糖脱氨酶(G6PDH)和异柠檬酸脱氢酶(IDH)活性的变化;采用电泳法对LDH、酯酶(EST)和超氧化物歧化酶(SOD)的同工酶酶谱进行了比较研究。实验结果表明,草鱼肝脏组织在低温下发生了代谢途径的转换和重组,而鲮鱼的肌肉组织和肝脏组织都只采取了增加酶浓度的方式。鲮鱼代谢转换机制的不完善,可能是鲮鱼不耐低温的重要原因之一。三组鲮鱼肝脏组织的酯酶(EST)同工酶谱在不同适应温度下的变化表明,鲮鱼肝脏组织的酯代谢在低温下发生了变化。最后,作者对混精授精法提高鲮鱼耐寒能力的作用进行了评价。

鲮的胚后发育

经人工授精获得鲮(Cirrhinus molitorella)受精卵,观察其胚后发育,描述9个主要发育期的仔鱼形态特征。结果表明,鲮胚后发育的主要特征是:身体较为透明,淡黄色,体形短小,孵出时,体长4.7mm,肌节数36(10+16+10);鳔一室期后,其胸鳍基部有2～3个黑色素花,头部较为尖突,尾柄下具黑斑;出膜5d后,全长7.1mm,卵黄被完全吸收,尾锥开始上翘;经过25d的生长和发育,进人幼鱼阶段,此时平均全长达30.1mm,初步呈成鱼体征。为监测及保护珠江水系早期鲮鱼资源,讨论鲮与其他几种常见鱼类胚后发育形态差异。

鱼类低温适应机制的研究——Ⅱ.驯化温度对草鱼和鲮鱼肌肉线粒体膜脂肪酸组成和胆固醇含量的影响

采用气相色谱法和气相色谱/质谱联用法对不同温度驯养的草鱼和鲮鱼肌肉线粒体膜脂肪酸组成进行了分析。10℃适应的草鱼和25℃适应的草鱼相比,肌肉线粒体膜脂肪酸中不饱和脂肪酸/饱和脂肪酸(U/S)值明显升高,脂酰链平均长度也从25℃时的19.08个碳原子增加到10℃时的20.46个碳原子。而鲮鱼的脂肪酸组成在不同适应温度下的变化不明显。此外,还测出了不同驯养温度下草鱼和鲮鱼肌肉线粒体中胆固醇含量的变化,发现两种鱼的胆固醇含量在低温下都显著下降。作者认为,低温适应下的草鱼由于肌肉线粒体的脂肪酸组成和胆固醇含量都发生变化,因而其肌肉线粒体膜的流动性明显增加;而鲮鱼肌肉组织线粒体中胆固醇含量虽也减少,但脂肪酸组成变化甚微,因此,鲮鱼肌肉组织线粒体膜流动性增加很有限。这可能就是鲮鱼耐寒能力差的重要原因之一。

鲮原种群体的D-loop序列分析

设计了1对可从鲮总DNA中扩增出线粒体D-loop区的引物,获得了937bp的鲮D-loop全序列。应用该对引物对鲮原种群体(子群体h11个样本,子群体q10个样本)进行PCR扩增,测序获得了5′端750bp的有效序列。21个个体共检测到15种单倍型,29个变异位点(4%)。遗传多样性分析发现,原种群体的序列差异为1.0%,子群体h与子群体q各自的序列差异为1.2%和0.9%。UPGMA分子系统树显示,用于研究的21个样本相互混杂,子群体h与子群体q并未出现独立的分支,表明该批鲮原种的子群体h和子群体q并非2个相互独立的母系来源。