大鼠腰多裂肌卫星细胞的分离培养与鉴定

目的建立一种有效的大鼠腰多裂肌卫星细胞(MSC)分离、纯化、培养及鉴定方法。方法取4周龄雌性SD大鼠腰4～5节段多裂肌,用Ⅰ型胶原酶消化,采用差速贴壁法纯化腰多裂MSC,采用免疫荧光细胞化学染色检测配对核转录因子7(Pax7)、成肌分化抗原(MyoD)、肌球蛋白重链(MyHC)的表达进行鉴定。结果通过分离、纯化得到的MSC形态为圆形,折光性强,培养一段时间后,细胞呈梭型。分离所得到的细胞具有一致的生长方式和形态特点。免疫荧光细胞化学染色结果显示,分离得到的大鼠腰多裂肌MSC在静止期表达Pax7、增殖期表达MyoD、分化早期表达MyHC。结论建立了一种简单、高效的分离培养及鉴定大鼠腰多裂肌MSC的方法。

电针介入时机对腰多裂肌损伤模型大鼠Foxo1、Myostatin、Myod蛋白表达的影响

目的:观察不同电针介入时机对腰多裂肌损伤大鼠多裂肌叉头蛋白(Foxo1)、肌肉生长抑制素(Myostatin)、成肌分化因子(Myod)蛋白表达的影响。方法:雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组、即刻电针组、24 h电针组、48 h电针组,每组8只。以多裂肌肌注0. 5%布比卡因复制腰多裂肌损伤模型。各电针组分别在造模后即刻、24 h、48 h开始电针双侧"委中""肾俞",连续干预7 d。以Western blot检测各组多裂肌Foxo1、Myostatin、Myod蛋白表达水平。结果:与空白组比较,模型组Foxo1、Myod蛋白表达水平显著升高(P <0. 01);与模型组比较,即刻电针组、48 h电针组Foxo1、Myostatin蛋白表达水平降低(P <0. 01,P <0. 05),24 h电针组Foxo1、Myostatin蛋白表达水平显著降低(P <0. 01),Myod蛋白表达水平显著升高(P <0. 01);与24 h电针组比较,即刻电针组Myostatin蛋白表达水平升高(P <0. 05)、Myod蛋白表达水平显著降低(P <0. 01),48 h电针组Foxo1蛋白表达水平显著升高(P <0. 01)、Myod蛋白表达水平显著降低(P <0. 01)。结论:电针促进多裂肌修复的最佳介入时机可能为损伤后24 h。

电针后血清干预对多裂肌卫星细胞增殖、Collagen I及MMP2表达的影响

目的观察电针"委中"穴后的血清对大鼠腰多裂肌卫星细胞增殖、胶原蛋白I(Collagen I)、基质金属蛋白酶2(MMP2)表达的影响,从血清学角度探讨电针"委中"穴促进多裂肌损伤后修复的部分作用机制。方法25只SPF级雄性SD大鼠,随机分为正常组、模型组、电针组,每组8只。腰4-5节段多裂肌注射0.5%的布比卡因建立多裂肌损伤模型。选取双侧"委中"穴进行电针治疗(20 min/次,1次/日,2/100 HZ,1-2 mA,共3次);正常组、模型组不予电针干预,第4d收集各组大鼠血清,制备无菌针刺血清。使用各组针刺血清培养原代MSCs,CCK-8检测MSCs增殖情况;WB检测Collagen I、MMP2蛋白表达情况。结果与正常血清组比较,模型血清组MSCs增殖速度加快(P<0.01),Collagen I、MMP2含量升高(P<0.01,P<0.05);与模型血清组比较,电针血清组MSCs增殖速度加快(P<0.01),Collagen I含量明显降低(P<0.01),MMP2含量明显升高(P<0.01)。结论电针"委中"后血清可能通过良性调节细胞外基质中Collagen I、MMP2的表达促进MSCs增殖,加快受损多裂肌的再生修复过程。

电针“委中”大鼠血清对多裂肌卫星细胞成肌分化因子和周期蛋白表达的影响

目的观察电针"委中"大鼠血清对大鼠腰多裂肌卫星细胞成肌分化因子MyoD、周期蛋白CDK4、P57和CyclinD表达的影响,从细胞周期角度分析电针"委中"血清促进损伤多裂肌再生修复的起效机制。方法SD大鼠随机分为空白组、模型组和电针"委中"组,每组8只。通过肌肉注射0.5%布比卡因制备多裂肌损伤模型,电针组选取"委中"穴进行电针治疗,每日1次,每次20 min,第4日收集血清。培养原代大鼠腰多裂肌卫星细胞,随机分为空白血清组、模型血清组、电针"委中"血清组、抑制剂血清组(电针"委中"血清中加PI3K抑制剂LY294002),以对应血清分别培养1 d,免疫印迹法检测肌卫星细胞MyoD、CDK4、P57和CyclinD蛋白表达。结果造模后,各血清组MyoD、CDK4和P57表达水平均显著升高(P <0.01);与模型血清组对比,电针"委中"血清组MyoD、CDK4升高(P <0.05或P <0.01)而P57显著降低(P <0.01);与电针"委中"血清组对比,加入LY294002抑制剂后MyoD、CDK4降低(P <0.05或P <0.01)而P57显著升高(P <0.01)。与空白血清组对比,电针"委中"血清组CyclinD升高(P <0.05),其他各组对比差异无统计学意义(P> 0.05)。结论电针"委中"血清可通过上调MyoD、CDK4的表达,并下调P57的表达,加速肌卫星细胞增殖的周期性进程,促进损伤多裂肌的良性修复。

多时间点电针对腰多裂肌损伤大鼠HGF及相关因子影响

目的观察多时间点电针对大鼠腰多裂肌损伤模型肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)及其特异性受体c-Met以及细胞性骨髓瘤样癌基因(cellular-myelocytomatosis oncogene,c-Myc)的影响。方法将SPF级雄性SD大鼠54只随机分为空白组、模型组和电针组,每组18只;再根据干预时间点每组分1 d、3 d、7 d 3个亚组,各组6只。除空白组外,余36只大鼠复制布比卡因腰多裂肌损伤模型。电针组造模后24 h电针干预双侧委中穴。同步取双侧多裂肌组织,HE染色观察肌纤维改变;免疫组化法观察HGF、c-Myc阳性表达;Western blot法观察c-Met表达。结果与空白组比,模型组1 d大鼠腰多裂肌HGF、c-Met阳性表达值低(P<0.01),c-Myc阳性表达高(P<0.05),模型组3 d、7 d腰多裂肌c-Met表达量低(P<0.01)。与模型组比较,电针组1 d组腰多裂肌HGF表达较高、c-Met表达较低(P<0.01或P<0.05),电针组3 d组腰多裂肌c-Met表达量较高(P<0.01),电针组7 d组腰多裂肌c-Myc表达较高、c-Met表达较低(P<0.01或P<0.05)。结论电针委中穴早期腰多裂肌HGF、c-Met和c-Myc表达均上调,促肌卫星细胞增殖,加速腰多裂肌损伤后修复。

电针血清对多裂肌卫星细胞增殖及Pax-7、成肌分化抗原、磷酸化蛋白激酶B表达的影响

目的:观察电针血清对大鼠多裂肌卫星细胞增殖及Pax-7、成肌分化抗原(MyoD)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白表达的影响,从血清学角度探讨电针促进多裂肌损伤修复的部分作用机制。方法:SD大鼠随机分为正常组、模型组、电针委中组、电针肾俞组,每组各8只,采用0.5%布比卡因肌肉注射复制多裂肌损伤模型,各电针组分别选取"委中"穴、"肾俞"穴进行电针治疗,每日1次,每次20min,4d后收集血清。原代培养大鼠腰多裂肌卫星细胞并进行鉴定,随机分为正常血清组、模型血清组、电针委中血清组、电针委中血清+LY 294002组、电针肾俞血清组、电针肾俞血清+LY 294002组,分别以各组血清培养24h,CCK-8、EdU法观察肌卫星细胞的增殖,Western blot法检测肌卫星细胞Pax-7、MyoD、p-Akt蛋白表达。结果:与正常血清组相比,模型血清组多裂肌卫星细胞增殖速度明显加快(P<0.01),两电针血清组又高于模型血清组(P<0.01)。与正常血清组相比,模型血清组MyoD、p-Akt表达明显升高(P<0.05),两电针血清组高于模型血清组(P<0.05,P<0.01)。与电针血清组相比,加LY 294002后,细胞增殖速度及MyoD、p-Akt表达均显著下降(P<0.01,P<0.05)。各组之间Pax-7蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论:电针"委中"血清和电针"肾俞"血清均可通过磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B通路促进肌卫星细胞的增殖,且有促进成肌分化的趋势。