结核分枝杆菌调节蛋白RelA的原核表达及多克隆抗体制备

目的:克隆编码结核分枝杆菌调节基因RelA并在大肠杆菌中表达,纯化后制备兔抗RelA的抗体。方法:利用PCR从结核分枝杆菌H37Rv株中扩增RelA基因,构建重组表达质粒pET-32a(+)-RelA;以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性重组菌株,IPTG诱导目的蛋白表达,在变性条件下对目的蛋白进行镍离子亲和层析纯化,通过SDS-PAGE和Westem blot鉴定目的蛋白的表达及反应原性;以表达的RelA蛋白免疫家兔,制备抗RelA的多克隆抗体并进行效价及特异性鉴定。结果:扩增了RelA基因,克隆于表达载体pET-32a(+)中,PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,测序证实正确。经诱导在大肠杆菌中表达出相对分子质量(Mr)为120 000的目的蛋白;纯化的RelA免疫家兔后,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价达到1∶6 400以上,且具有良好的特异性。结论:已成功构建RelA基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;制备出兔抗RelA抗体,效价及特异性均良好,为进一步研究RelA蛋白在结核病中的致病机制奠定了基础。

广州市越秀区及海珠区非结核分枝杆菌流行状况

目的:了解广州市越秀区及海珠区非结核分枝杆菌流行状况。方法:回顾性对广州市越秀区、海珠区两个结核病防治所2010-2012年就诊的痰抗酸杆菌涂片阳性可疑肺结核患者,进行痰结核分枝杆菌培养及菌种鉴定,分析肺结核诊断的准确性。结果:2010-2012年共2 014例痰涂片及培养抗酸杆菌阳性,1 630例(80.9%)为结核分枝杆菌复合群(MTC),384例(19.1%)为非结核分枝杆菌(NTM)。2010-2012各年度痰培养抗酸杆菌阳性菌株中,NTM分离率分别为17.6%、17.1%、21.2%。384株NTM中共有79株进行了NTM菌种或复合群鉴定,快速生长型分枝杆菌占50.6%,慢速生长型分枝杆菌占49.4%。结论:广州市越秀区、海珠区可疑肺结核患者痰标本中NTM分离率为19.1%。临床上对涂阳肺结核患者疗效欠佳时,应及时排除非结核分枝杆菌肺病。

莫西沙星与左氧氟沙星对结核分枝杆菌的交叉耐药性研究

目的探讨莫西沙星(MXF)与左氧氟沙星(LVF)对结核分枝杆菌的交叉耐药性及耐药基因突变位点,为临床用药提供理论依据。方法选取结核分枝杆菌标准株H37Rv和73株左氧氟沙星耐药的耐多药结核分枝杆菌(MDR-TB)临床分离株以及5株对左氟沙星敏感的MDR-TB临床分离株,以试管二倍稀释法采用7H9培养基,测定以上菌株对MXF和LVF的MIC;通过直接测序法测定gyrA基因喹诺酮类药物耐药决定区(QRDR)320 bp的基因突变位点。结果MXF的MIC比LVF低4～8倍;H37Rv未发生gyrA基因突变;78株MDR-TB临床分离株均有Ser95Thr突变;73株LVF耐药的MDR-TB菌株中,35株(47.94%)对LVF低耐药(MIC为1～8μg/ml)的菌株和31株(42.46%)对LVF高耐药株中,除4株只有Ser95Thr突变外,其他菌株同时有Ala90Val、Asp94His、Asp94Asn、Asp94Gly、Asp94Ala、Asp94Tyr突变。结论莫西沙星较左氧氟沙星的抗结核活性强4～8倍,为不完全交叉耐药;gyrA基因90位和94位突变与MDR-TB菌株对LVF、MXF耐药有关,低耐药与高耐药的突变氨基酸种类有差别,有望将测序作为临床左氟沙星分子药敏试验方法。

结核分枝杆菌菌体蛋白双向电泳技术的优化

目的：提取结核分枝杆菌菌体蛋白并建立一种利用双向电泳分离结核分枝杆菌蛋白质组的方法。方法：分离提取结核分枝杆菌菌体蛋白。样品采用不同pH梯度的IPG胶条进行第一向等电聚焦,12％SDS-PAGE凝胶进行二向电泳。银染后双向电泳图谱用Molecular Image Fx激光图像扫描仪扫描,PDQuest 6．0软件完成配比分析。结果：优化了结核分枝杆菌菌体蛋白的提取方法,用裂解液8mol／L尿素结合2mol／L硫脲,140mmol／LDTT,0．5％biolyte,4％CHAPs,400mg／ml OG处理,成功提取了蛋白,并通过结核分枝杆菌双向电泳技术体系的优化,建立了结核分枝杆菌菌体蛋白的分解图谱。pH4-7及pH7-10两胶面上共1387个点,占所检测到的蛋白总数的86％,绝大部分(1194个)蛋白位于pH4-7范围内。结论：为进一步开展结核分枝杆菌的比较蛋白质组学研究提供了方法学参考。

应用流式细胞术检测结核分枝杆菌药敏试验

目的建立流式细胞术检测结核分枝杆菌药敏试验的方法。方法利用结核分枝杆菌水解FDA的特点，选用FDA作为荧光染料，用流武细胞术检测H37Rv标准株，临床分离到的20株结核分枝杆菌对RFP、INH、SM和EMB的敏感性，根据细菌培养物在不同浓度药物作用后所检测到的平均荧光强度与阳性对照的比值，从而推断MIC值，并于传统的绝对浓度法检测结果进行比较。结果20株结核分枝杆菌的流武细胞术所得药敏试验结果与绝对浓度法基本一致。结论所建立的流武细胞术检测结核分枝杆菌药敏试验可以应用于临床，并有快速、准确、方便的优点。

注射用母牛分枝杆菌预防性治疗潜伏性结核感染的细胞免疫机制

目的评价母牛分枝杆菌(微卡)在预防性治疗潜伏性结核感染中的细胞免疫学作用机理。方法对入学的大学新生进行PPD筛检和X线透视检查,确定潜伏结核感染人群,随机分为对照组、化学药物治疗组和微卡治疗组,每组中各随机选择30例,于用药前、用药后1个月、用药后6个月分别采集血样,采用流式细胞术检测各项细胞免疫学指标,动态观察三组免疫前后细胞免疫学指标的变化情况。结果治疗1个月后,微卡组外周血中CD3+、CD4+、CD8+、NK、NKT和γδT各细胞亚群的比例较之对照组普遍升高,各组IL4+、IFNγ+表达也显著升高;治疗6个月后,微卡组CD4+T细胞比例显著高于同期的对照组和化疗组;CD8+、γδT各细胞亚群的比例与用药后一个月相比呈下降趋势,其中CD8+T细胞与同期对照组比较下降显著;微卡组IL4+表达与同期化疗组、对照组比较显著性降低,同时IFNγ+表达较用药前水平显著升高。结论微卡能显著提高潜伏结核感染者固有和获得性细胞免疫水平,尤其是增高并维持CD4+细胞的比例,降低CD8+细胞的比例,并能够调节Th1/Th2平衡,提示微卡对潜伏性结核感染有预防性免疫治疗作用,避免潜伏结核感染者的发病。

不同检测方法在结核性脑膜炎诊断中的应用价值

目的探讨外周血T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)、脑脊液结核分枝杆菌培养及结核菌素试验(PPD试验)在结核性脑膜炎诊断中的应用价值。方法选择2015年1月~2016年12月延安大学附属医院收治的疑似结核性脑膜炎患者65例为研究对象,所有患者均行外周血T-SPOT.TB、脑脊液结核分枝杆菌培养及PPD试验。观察比较3种检测方法的在结核性脑膜炎诊断中的灵敏度、特异度等。结果 65例患者中,35例为结核性脑膜炎患者,30例为非结核性脑膜炎患者。结核性脑膜炎患者中,T-SPOT.TB阳性率为74.29%,明显高于结核分枝杆菌培养及PPD试验的阳性率(40.00%,57.14%),且PPD试验阳性率高于结核分枝杆菌培养,差异有统计学意义(P<0.05)。在非结核性脑膜炎患者中,PPD试验阳性率为26.27%,明显高于T-SPOT.TB及结核分枝杆菌培养的阳性率(10.00%,0.00%),差异有统计学意义(P<0.05)。在结核性脑膜炎诊断中,T-SPOT.TB的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为89.66%、75.00%、74.29%、90.00%,均明显高于PPD试验的71.43%、59.46%、57.14%、73.33%,差异有统计学意义(P<0.05);T-SPOT.TB在结核性脑膜炎诊断中的特异度、阳性预测值均高于结核分枝杆菌培养的52.63%、40.00%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论外周血T-SPOT.TB检测在结核性脑膜炎诊断中具有较高的敏感度、特异度,有助于结核性脑膜炎的快速诊断,值得临床推广。

结核分枝杆菌抗毒素higA的原核表达及多克隆抗体制备

目的克隆编码结核分枝杆菌抗毒素基因hig A并在大肠杆菌中表达,纯化hig A蛋白后,制备兔抗hig A的多克隆抗体。方法利用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增hig A基因;构建重组表达质粒p ET-32a(+)-hig A;筛选出阳性重组质粒后,转化大肠杆菌BL21,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导目的蛋白表达;利用SDS-PAGE与Western blot法鉴定目的蛋白的表达;以纯化的hig A蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗hig A的多克隆抗体并进行效价及特异性鉴定。结果成功扩增出了hig A基因,克隆于载体p ET-32a(+)质粒中,PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,测序证实正确;转化大肠杆菌BL21后能成功诱导hig A蛋白[相对分子质量(Mr)36 630]的表达;利用纯化的hig A蛋白免疫新西兰大白兔后,能有效地刺激特异性hig A抗体的产生,抗体的效价达到1∶3200以上。结论成功在大肠杆菌中表达出hig A蛋白,并制备出效价及特异性良好的兔抗hig A多克隆抗体。

结核分枝杆菌Rv2389c基因的克隆和原核表达

目的:克隆并原核表达结核分枝杆菌Rv2389c基因。方法:培养结核分枝杆菌,提取其基因组,PCR扩增出485bp的Rv2389c基因,克隆入pSP73载体,测序分析。将该目的基因亚克隆入pGEX-4T-2表达载体,测序证实正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),待大肠杆菌增菌至A600nm值为0.6时,用0.3 mmol/L IPTG在30℃诱导表达重组蛋白。结果:测序结果证实获得了Rv2389c基因,其序列与GenBank中报道完全一致。构建了重组表达质粒,表达的蛋白以12%SDS-PAGE分析,在Mr约42KD处出现一条新生蛋白带,经凝胶薄层扫描检测,表达量约占菌体蛋白的26.8%。结论:成功克隆了结核分枝杆菌Rv2389c基因并得到了其大肠杆菌表达产物,为进一步研究其活性和功能奠定了基础。

真核表达编码Ag85A基因重组体的构建

抗原85复合体(Ag85)是BCG合成的能够刺激机体产生细胞免疫和体液免疫的多种成分之一,Ag85A是抗原85复合体组成成分之一,可显著刺激细胞免疫功能增强。为研究经口接种Ag85A的DNA疫苗的免疫效应,根据结核分枝杆菌Ag85A的基因序列自行设计了一对PCR引物,以人型结核杆菌H37Rv标准毒力株的DNA为模板,经过PCR扩增出Ag85A目的基因,纯化PCR产物TA克隆入载体pUCm-T载体,蓝白斑筛选将回收的PCR产物用限制性核酸内切酶Xhol和BamHI双酶酶切后,经T4DNA连接酶作用,与真核表达载体pCDNA3.1+连接,筛选得到的阳性克隆经DNA测序鉴定证实为Ag85A基因,且被克隆到载体pCDNA3.1+中的CMV启动子的下游,成功构建并鉴定的真核表达载体pCDNA3.1+携带Ag85A基因的重组体,命名为pCDNA3.1+/Ag85A。将其转化大肠埃希菌并使之大量扩增,并采用无内毒素提取质粒方法收集此重组质粒DNA,即为可经口途径喂饲小鼠的结核杆菌Ag85A的DNA疫苗,为口服DNA疫苗的临床应用研究奠定基础。

乌体林斯对慢性阻塞性肺病患者免疫功能的影响

【目的】研究乌体林斯注射液对慢性阻塞性肺病（COPD）稳定期患者免疫功能的影响及，临床意义。【方法】将COPD稳定期患者随机分为乌体林斯治疗组和对照组，对比两组患者用药前后急性加重的发病频率、住院次数及血清CD3＋、CD4＋、CD8＋及CD4＋／CD8＋的变化。【结果】乌体林斯治疗组较对照组患者急性加重发病频率、住院次数明显减少，治疗组用药前后比较血清CD4＋及CD4＋／CD8＋水平有明显增加；和对照组比较亦有明显增加。【结论】乌体林斯能提高COPD患者的免疫功能，减少COPD急性加重频率，减少住院次数，提高生活质量，是一种良好的免疫调节剂，值得临床推广使用。

噬菌体检测技术(PhaB)检测抗结核药物乙胺丁醇的耐药性

目的探讨噬菌体检测技术(PhaB)在检测抗结核药物乙胺丁醇耐药性中的价值。方法应用PhaB测定30株结核分枝杆菌(MTB)临床分离株对乙胺丁醇(E)的耐药性,并与罗氏药敏结果比较。结果PhaB检测E药敏结果与罗氏药敏结果符合率为90%。如以绝对浓度法为判断标准,则PhaB检测E药敏的敏感性为95.6%,特异性为71.4%,阳性预测值(PPV)为91.6%,阴性预测值(NPV)为83.2%,准确性为90%。结论PhaB检测E药敏结果与绝对浓度法符合率较高,可作为结核分枝杆菌耐药性的快速筛选方法。

微卡(VACCAE)联合2H_3R_3Z_3E_3/4H_3R_3方案治疗初治涂阳肺结核的临床效果

目的应用微卡(VACCAE)联合常规抗结核药物2H3R3Z3E3/4H3R3治疗初治涂阳肺结核的临床疗效。方法选取100例初始涂阳肺结核患者,随机分为对照组50例和观察组50例,两组均采用"世界银行贷款+中国结核病控制项目"的2H3R3Z3E3/4H3R3方案治疗,观察组在上述常规化疗药基础上联用微卡22.50μg深部肌肉注射;观察两组的痰菌阴转率、病灶吸收率、空洞闭合率、临床症状改善情况、不良反应发生率。结果治疗1个月后,观察组临床症状完全消失率显著高于对照组(P<0.05)。观察组的痰菌转阴率、病灶吸收率、空洞闭合率均优于对照组(P<0.05)。微卡注射后无严重不良反应。结论微卡联合常规抗结核药物2H3R3Z3E3/4H3R3方案治疗初治涂阳肺结核能够快速缓解临床症状,且疗效显著不良反应小,具有临床应用价值。

非结核分枝杆菌肺病的CT征象分析

目的：探讨非结核分枝杆菌肺病的CT影像学表现。方法：回顾性分析2005年11月至2009年11月在本院确诊的30例非结核分支杆菌肺病的CT影像学资料，研究其cT影像学特点。结果：30例患者病灶跨双肺三叶及以上分布的病例占90％（27／30）；病变通常以多种形态混杂存在，以斑片状浸润影及条索影并存为多见，占53．3％（17／30）；合并支气管扩张者占93．3％（28／30），合并空洞63．3％（19／／30）及胸膜肥厚粘连43．3％（13／30）；但淋巴结肿大及胸腔积液少见。结论：非结核分枝杆菌肺病的cT以合并支气管扩张及多部位多形态混杂为其主要特征。

糖尿病合并肺结核患者结核分枝杆菌L型感染的研究

目的研究糖尿病合并肺结核患者结核分枝杆菌L型的感染情况,探讨其对临床的指导意义。方法选取2009年1月至2011年12月淮南东方医院总院收治的初诊肺结核患者128例。其中,糖尿病合并肺结核患者60例(研究组),单纯涂阳肺结核(没有合并糖尿病)患者68例(对照组)。两组患者均进行痰结核分枝杆菌细菌型和L型培养,并对培养物进行涂片镜检、鉴定,同时对L型培养物进行PCR鉴定,并对所分离到的L型菌株进行回复性的实验。结果研究组60例糖尿病合并肺结核患者中,结核分枝杆菌细菌型培养阳性13例(21.67%),L型培养阳性28例(46.70%),两者之间差异极其显著(χ2=7.86,P<0.05);其中糖化血红蛋白(HbA1c)≤6.5%的糖尿病合并肺结核患者L型阳性检出率为33.40%,糖化血红蛋白(HbA1c)>6.5%L型阳性检出率为86.10%;两者之间差异显著(χ2=8.76,P<0.05)。经PCR鉴定,28例L型培养阳性物中,23例呈阳性反应,5例呈阴性反应。对照组68例单纯性肺结核患者中,细菌型培养阳性38例(55.89%),L型培养阳性4例(5.89%),PCR鉴定均呈阳性反应。结论糖尿病患者合并肺结核后结核分枝杆菌L型的感染率较高;其中血糖控制不佳的患者结核分枝杆菌L型的感染率比血糖控制较好的患者感染率高。大多数结核分枝杆菌L型具有回复为细菌型而导致结核病的内源性复发的潜在倾向。糖尿病是并发结核的高危因素,我们通过结核分枝杆菌L型检测可以发现隐藏的糖尿病合并肺结核阳性患者,减少漏诊、误诊现象。而治疗效果不佳的糖尿病合并肺结核患者,能通过结核分枝杆菌L型的检测证实有结核分枝杆菌L型的存在,能够及时调整治疗方案,提高诊疗效果,缩短病程。取得良好的社会效益。

结核分枝杆菌PPE17蛋白原核表达与抗原性分析

目的利用原核系统生产重组结核分枝杆菌PPE17蛋白,Western-Blot方法鉴定PPE17蛋白的抗原性和特异性。方法 PCR扩增Rv1168c基因序列然后克隆至原核表达载体pET-24b中,对PPE17蛋白进行表达和纯化,并以Western blot分析其抗原性和特异性。结果 PPE17蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,复性后的PPE17蛋白与结核病患者阳性血清标本呈强阳性反应,与健康人血清标本无反应。结论 PPE17蛋白在大肠杆菌中以包涵体表达形式存在,具有抗原特异性和免疫原性,可开发为结核病临床诊断试剂。

微卡联合2HRZE2HR超短程方案治疗初治涂阳肺结核的临床效果及对患者生活质量的影响

目的探讨微卡联合2HRZE2HR超短程方案治疗初治涂阳肺结核(TB)的临床效果及对患者生活质量的影响。方法将66例初治涂阳TB患者根据随机数字表法分为对照组与研究组,各33例。对照组采用2HRZE4HR方案治疗,研究组采用微卡联合2HRZE2HR超短程方案治疗。比较两组的治疗效果。结果研究组肺部病灶吸收效果优于对照组(P<0.05)。研究组的痰涂转阴率高于对照组,随访1年后复阳率低于对照组(P<0.05)。治疗后,两组的FEV1%pre、FEV1/FVC、各项生活质量评分均升高,且研究组高于对照组(P<0.05)。结论微卡联合2HRZE2HR超短程方案治疗初治涂阳TB的临床效果确切,可有效促进肺部病灶吸收和痰涂转阴,改善患者的肺功能,提高其生活质量,预防痰涂复阳。

奶牛结核病两种检测方法的比较试验

采用自制的牛结核病PCR快速诊断试剂盒,对某奶牛场100头份奶牛奶样进行检测,检出阳性牛16头;采用结核菌素皮内注射法(PPD)检出阳性牛17头,结果符合率为94.11%。用牛结核病PCR快速诊断试剂盒检测所需时间为6 h,显示其快速、特异等优点,为今后牛结核病的检疫工作提供了1个新方法。

结核分枝杆菌三种蛋白在结核病血清学诊断中的评价研究

目的对结核分枝杆菌相对分子质量为38000（以下采用38kD表示）、线粒体通透性转换蛋白64 （ mitochondrial permeabilitytransition 64, MPT-64 ）和肝素结合血凝素（ heparin-binding haemagglutinin, HBHA ）蛋白在外周血中抗体的表达水平进行检测和比较，并对它们在结核病血清学方面的诊断价值进行评估。方法选取2012年7月至2013年10月北京胸科医院收治的肺结核患者作为活动性肺结核（ATB）组，共78例；选取同期36例潜伏结核感染（LTBI）患者作为LTBI组；同期在北京胸科医院进行体检的31名健康人群（HC）作为HC组。将本实验室前期纯化的38kD、MPT64和HBHA作为抗原应用于免疫学的检测，采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测血清中三种蛋白抗体的表达水平，经过统计学处理后，分别比较ATB、LTBI和HC三组之间的差异，并结合受试者工作特征曲线计算各蛋白抗原的敏感度和特异度，评价三种蛋白血清抗体的临床诊断价值。结果ELISA检测ATB组38kD蛋白抗体的吸光度（A）450nm处的A值（0．343±0．120）高于LTBI组（0.221±0．102）和HC组（0．143±0．097），差异有统计学意义（t=3．07，P〈0．05）；MPT64抗体的A450值（0．234±0．102）高于LTBI组（0．198±0．087）和HC组（0．123±0．075），差异有统计学意义（t=-3．79，P〈0．05）；HBHA抗体的A450值（0．263±0．113）高于LTBI组（0．188±0．091）和HC组（0．148±0．078），差异有统计学意义（t=2．70，P〈0．05）.以38kD、MPT64和HBHA蛋白抗体表达水平从LTBI组鉴别ATB组时的受试者工作特征（ROC）曲线下面积（AUC）分别为0．78、0．61和0．62，敏感度分别为71．79％、62．82％和52．56％，特异度为72．22％、58．33％和69．44％；从HC组鉴别ATB组时的AUC分别为0．91、0．81和0．79，敏感度分别为87．17％、69．23％和7308％，特异度为80．65％、74．19％和74．19％；从HC组鉴别LTBI组AUC分别为0．63、0．75和0．69，敏感度分别为58．33％、77．78％和63．89％，特异度为64．52％、51．61％和74．19％。结论MTB38kD、MPT64和HBHA蛋白都有较好的免疫反应性，3种蛋白抗体在不同患者人群血清中的表达水平有差异，对肺结核诊断价值的评估结果表明采用ELISA对外周血中MTB蛋白抗体进行检测可作为结核病临床检测诊断的辅助方法。

结核分枝杆菌毒素蛋白higB的原核表达及分析

目的克隆编码结核分枝杆菌毒素基因higB并在大肠杆菌中表达。方法利用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增higB基因;构建重组表达质粒pET-32a(+)-higB;筛选出阳性重组质粒后转化大肠杆菌,诱导目的蛋白表达;利用SDS-PAGE与Western-blot鉴定目的蛋白的表达。结果成功扩增出了higB基因,克隆于载体pET-32a(+)质粒中,PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,测序证实正确;转化大肠杆菌BL21后higB蛋白没有发生表达。结论已成功构建结核分枝杆菌毒素基因higB的原核表达栽体,但大肠杆菌BL21不能表达出higB蛋白。