滑液囊支原体活疫苗(MS-H株)在黄羽肉种鸡中的免疫效果探索

通过评估滑液囊支原体(Mycoplasma synovia,MS)MS-H株活疫苗在黄羽肉种鸡中的免疫效果,为MS在我国鸡群中的感染防控技术研究提供临床参考。该试验通过对6批次黄羽肉种鸡群在21和90日龄分别进行MS活疫苗(H株)免疫,定期测定血清MS抗体水平,并通过三合一方式采集上颚裂拭子检测MS-H株和MS野毒菌株在鸡群中的定殖率或感染率,评估疫苗免疫效果。试验结果表明:①通过血清MS抗体水平检测发现所有鸡群的鸡在1日龄呈现中等水平的MS母源抗体,平均滴度在3000~5000,随着日龄的增加在14、28、42日龄时MS母源抗体基本呈现阴性;而所有鸡群在56日龄时MS抗体陆续转变为阳性。②6批次鸡群中有2批次在42日龄首次检出野毒菌株,阳性率分别为100%、37.5%,其余4批次鸡群分别在70、70、84、112日龄开始检出野毒菌株,阳性率均在25%以下。③通过对MS-H株在鸡群中的持续检测发现6批鸡群在疫苗免疫后1周均检出了MS-H株,大部分鸡群在免疫后3~5周定殖率达到了最高,均超过了80%,部分鸡群的定殖率可达100%,且直到52周龄时MS-H株的检出率仍维持在62.5%~87.5%。可见,MS-H株活疫苗在黄羽肉种鸡中两次免疫,MS-H株可以较好的在鸡群中定殖,持续时间可达52周,且MS抗体水平适中,野毒感染率较低且不能在鸡群中发生大面积的水平传播。因此,MS-H株疫苗在鸡群中两次免疫其疫苗株在鸡群中定殖率较高且维持时间较长,可以阻止MS野毒在鸡群中的感染和水平传播,具有良好的免疫效果。

猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体和猪瘟疫苗不同免疫程序的免疫效果比较分析

为了评估不同免疫策略对猪场免疫效果和经济效益的影响,以确定最佳的疫苗免疫程序,本试验将处于产前1个月的四胎次健康三元母猪随机分为2个组,A组(联合免疫组)母猪于产前27 d联合免疫猪圆环病毒2型基因工程疫苗、猪肺炎支原体灭活疫苗和猪瘟活疫苗(圆柯欣+柯喘宁+稳柯健),其所产仔猪于21日龄联合免疫圆柯欣、柯喘宁和稳柯健;B组(对照组)母猪于产前34和27 d分别免疫稳柯健、猪圆环病毒疫苗和猪肺炎支原体疫苗二联疫苗(圆-支二联疫苗),其所产仔猪于14日龄免疫圆-支二联疫苗,28日龄免疫稳柯健。统计和分析免疫各组临床指标、生产性能和持续性抗体水平。结果显示,免疫疫苗后,2个组的母猪采食情况均正常;2个组的仔猪整体精神状态良好,哺乳情况正常,均未出现咳嗽和喘气等呼吸道疾病。在试验期间内,2个组的母猪的窝产健仔数和仔猪出生健仔均重并无差别。A组和B组的出生至23日龄死淘率、出生至50日龄死淘率分别为3.77%、5.11%和4.07%、5.43%,A组略优于B组。抗体监测结果显示,A组母猪的CSFV和PCV2抗体水平较B组无显著差异(P>0.05);A组仔猪的CSFV抗体阳性率与B组无明显差异(P>0.05),而PCV2抗体水平在免疫早期阶段(21日龄)明显高于B组(P<0.05)。结果表明,猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体和猪瘟疫苗可以联合免疫,且免疫后相互之间不干扰。该联合免疫策略在确保免疫效果的同时,简化了疫苗免疫程序,为确定最佳的疫苗免疫程序提供了有价值的临床应用参考。

猪支原体肺炎活疫苗经肌肉注射的免疫效果评价

猪支原体肺炎活疫苗(168株)是一种以肺内注射途径免疫的弱毒活疫苗。为了拓展猪支原体肺炎活疫苗的免疫途径,评估猪支原体肺炎活疫苗(168株)配合佐剂以肌肉注射方式免疫猪群后的攻毒保护效果,选取20头7日龄猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)阴性仔猪,将其随机平均分成4组,分别为健康对照组、感染对照组、肌肉注射免疫组和肺内注射免疫组。在免疫后采集血样并检测其中的Mhp IgG抗体,在首次免疫后42 d人工感染Mhp组织毒(JS株),攻毒28 d后评估肺脏的病变情况并测定支气管肺泡灌洗液(BALF)中的Mhp含量。结果显示:免疫后肌肉注射免疫组动物产生了明显的Mhp特异性血清IgG抗体,而肺内注射免疫组动物在攻毒前未见明显的血清抗体;肌肉注射免疫组和肺内注射免疫组的攻毒保护率分别平均为88.89%和75.93%,且组间无显著性差异;感染对照组的BALF中Mhp单位含量极显著高于肌肉注射免疫组和肺内注射免疫组(P<0.01),2个免疫组间无显著性差异。结果表明:猪支原体活疫苗配合佐剂后经肌肉注射免疫可产生较好的免疫攻毒保护效果。本研究为猪支原体肺炎活疫苗(168株)实施肌肉注射免疫提供了临床数据支撑。

鸡毒支原体活疫苗(F36株)的免疫效果评估

鸡毒支原体在国内鸡场的感染率较高,疫苗免疫是防控鸡毒支原体的有效方法之一。本试验旨在观察鸡毒支原体活疫苗(F36株)免疫鸡群的安全性和有效性。选择体重相近的7日龄SPF鸡80羽,免疫组点眼免疫鸡毒支原体活疫苗(F36株),对照组点眼免疫生理盐水,于38日龄对免疫组和对照组鸡群采用鸡毒支原体R株攻毒,攻毒后每天观察鸡群采食、精神状况、呼吸道症状和死亡情况,分别于38日龄、52日龄对两组鸡进行称重,7日龄、14日龄、21日龄、38日龄、52日龄采血检测抗体,52日龄采集咽喉拭子做PCR检测,并于52日龄将所有鸡剖杀,做气囊病理性损伤和增重检查。结果表明:鸡毒支原体活疫苗(F36株)免疫鸡群后,未见明显免疫副反应与呼吸道症状,免疫组相对于对照组增重显著(P<0.05),抗体滴度更好,52日龄咽喉拭子PCR检测R株阳性率免疫组低于对照组,攻毒后免疫组对气囊保护率达99%,而对照组均出现气囊病变。本试验结果证实鸡毒支原体活疫苗(F36株)具备良好的安全性与有效性,为该疫苗产品免疫效果评估提供数据参考。

猪肺炎支原体P97R1抗原免疫刺激复合物的制备及对活疫苗免疫刺激能力的增强作用研究

为增强肌肉注射免疫条件下猪肺炎支原体(Mhp)活疫苗的免疫刺激能力,并补充其缺乏的针对重要黏附因子P97R1的应答,本实验采用透析法制备含有P97R1的免疫刺激复合物(ISCOM-P97R1),并将ISCOMP97R1作为活疫苗的佐剂,通过小鼠模型进行免疫学评价。结果表明,电镜下观察所制备的ISCOM-P97R1具有ISCOM的典型蜂窝状结构,直径为30 nm^40 nm,P97R1蛋白的包封率可达85.6%。免疫后7 d即可在小鼠血清中检测到高水平的特异性P97R1抗体,并且其针对Mhp全菌蛋白的抗体也显著高于无佐剂的活疫苗对照组。结果表明,ISCOM-P97R1对Mhp活疫苗免疫刺激能力具有显著的增强作用,同时可以有效诱导产生针对P97R1的免疫应答,进一步增强了疫苗的保护能力。

GEL 01佐剂联合猪支原体肺炎活疫苗黏膜接种的效果评估

为评估水性佐剂GEL 01对猪支原体肺炎活疫苗的黏膜接种效果的影响,本研究以小鼠为动物模型,将猪肺炎支原体(168株)活疫苗与水性佐剂GEL 01滴鼻免疫小鼠,于免疫后不同时间点收集血清和支气管肺泡灌洗液,检测其中抗原特异性抗体水平和相关细胞因子的分泌情况,并检测了GEL 01对小鼠淋巴细胞增殖的影响。结果显示Gel 01联合活疫苗黏膜接种后,支气管肺泡灌洗液中抗原特性抗体(IgG、IgG1、IgG2a和sIgA)的水平显著高于单独疫苗组,同时支气管肺泡灌洗液中Th1(IFN-γ)型、Th2(IL-4)型和Th17(IL-17)型细胞因子分泌显著增加;另外,GEL 01联合猪肺炎支原体活疫苗黏膜接种后,促进小鼠淋巴细胞的显著增殖,并同时上调血清中IgG、IgG1、IgG2a抗体水平。以上结果说明GEL 01作为黏膜佐剂配合猪支原体肺炎活疫苗使用时,可全面激活宿主免疫系统,尤其是与猪肺炎支原体感染免疫保护相关的呼吸道局部黏膜免疫和全身循环系统的细胞免疫。

清热解毒方对难治性支原体肺炎患儿支原体活体的影响

目的:探讨清热解毒方治疗对难治性支原体肺炎患儿支原体活体的影响。方法:选取本院难治性支原体肺炎住院患儿87例,治疗过程中因故不能坚持退出12例,最终入选75例,随机分为2组。对照组37例,采用阿奇霉素抗菌等治疗。治疗组38例,在阿奇霉素等治疗基础上加用清热解毒方(由生石膏、炙麻黄、桔梗、苦杏仁、连翘、蒲公英、鱼腥草、大青叶、白花蛇舌草等组成)。中药治疗1疗程前后分别采取2组患儿肺泡灌洗液,在超高倍镜下观察肺炎支原体活体变化。结果:治疗后治疗组与对照组患儿肺泡灌洗液支原体活体明显减少,二者比较差异有显著性(P<0.05)。结论:抑制肺炎支原体活体可能是清热解毒方治疗难治性支原体肺炎的作用机制之一。

重组蛋白CTB-P97R1对猪支原体肺炎活疫苗滴鼻免疫效果的评价

为提高滴鼻免疫条件下猪支原体肺炎活疫苗的免疫效果,本研究设计引物扩增猪肺炎支原体P97R1基因,融合至霍乱毒素B亚单位(CTB)基因下游,构建了重组质粒p ET-CTB-P97R1。重组菌经IPTG诱导表达、分离纯化得到r CTB-P97R1重组蛋白。利用体外神经节苷脂(GM1)结合试验检测r CTB-P97R1的佐剂活性。随后将r CTB-P97R1与活疫苗混合后滴鼻免疫小鼠,免疫后采血和收集小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF),分别检测其中的特异性Ig G抗体和s Ig A抗体的水平评价免疫效果。结果显示,r CTB-P97R1可以特异性结合GM1,具有生物学活性。小鼠免疫后的血清Ig G抗体显著高于活疫苗对照组(p<0.01),同时产生了高水平的P97R1特异性Ig G抗体(p<0.01);小鼠BALF中的s Ig A抗体也显著高于活疫苗对照组(p<0.05)。结果表明,r CTB-P97R1能够显著增强经滴鼻免疫的猪支原体肺炎活疫苗的免疫效力,同时可提升P97R1的免疫应答,有望作为经黏膜免疫的猪支原体肺炎活疫苗的新型佐剂。

猪支原体肺炎活疫苗佐剂体内外促进细胞免疫刺激能力的研究

为增强猪支原体肺炎活疫苗在肌肉注射免疫时的细胞免疫刺激能力,对7种猪支原体肺炎活疫苗可用佐剂的细胞免疫应答促进作用进行了体外及体内试验评价。7种佐剂中除皂角素外,其余6种对活疫苗活力皆无明显影响。用这6种佐剂体外刺激淋巴细胞,发现左旋咪唑、免疫刺激复合物基质、黄芪多糖和胞壁酰二肽可以在体外单独刺激或协同刀豆蛋白刺激小鼠脾淋巴细胞及猪外周血淋巴细胞增殖,其中免疫刺激复合物基质仅需ng/ml级别浓度即可起效,而壳聚糖和卡波姆不能在体外刺激细胞增殖。选用其中5种佐剂与活疫苗配合肌肉注射免疫小鼠,发现左旋咪唑、免疫刺激复合物基质、黄芪多糖、卡波姆可以显著增加机体针对猪肺炎支原体抗原的细胞免疫应答。结果表明,利用适当佐剂可以实现猪支原体肺炎活疫苗在肌肉注射条件下对机体细胞免疫应答的有效刺激。

猪支原体肺炎活疫苗(168株)的安全性研究

用健康易感仔猪进行同群感染试验和连续五代返强试验对猪肺炎支原体活疫苗(168株)进行安全性试验,同时也进行了该活疫苗单剂量、单剂量重复和大剂量试验及5批次疫苗免疫商品猪的临床试验。结果发现,猪支原体肺炎活疫苗(168株)免疫猪后,免疫猪和同群感染猪均未观察到典型的临床症状和病理变化;连续五代返强试验,试验猪均未观察到典型的临床症状和病理变化,说明该疫苗株未出现返强。单剂量、单剂量重复和大剂量试验及5批次疫苗的临床试验也未观察到不良反应。这说明受试批次猪支原体肺炎活疫苗(168株)具有良好的安全性。

猪支原体肺炎活疫苗(168株)的免疫效力研究

研究使用健康易感仔猪对3批猪支原体肺炎活疫苗(168株)分别进行了免疫效力试验、免疫期试验、临床效力试验、同类制品的免疫效力比较试验和免疫期比较试验,以及5批疫苗免疫商品猪的临床试验。结果表明:猪支原体肺炎活疫苗(168株)免疫仔猪60 d后,免疫组有80%以上的保护率,免疫后7个月,试验组仍有50%以上的保护率;同类制品免疫效力和免疫期比较试验结果表明两种猪支原体活疫苗差异不明显。临床观察和病理剖检结果表明免疫保护率在85%以上。以上结果都说明猪支原体肺炎活疫苗(168株)具有很好的免疫效力。

兽用疫苗支原体污染的PCR检测技术的建立及应用

根据支原体的16 S rRNA基因设计特异性引物,以兽用疫苗中常见的支原体DNA为模板进行PCR试验,优化反应体系,建立了兽用疫苗支原体污染的PCR 检测方法,并对市场上的兽用疫苗随机抽查检测,其检出率为24.4%(22/90)。结果表明该方法特异性强,灵敏度高,有望成为兽用疫苗支原体污染的检测方法之一。

兽用疫苗中霉形体污染的套式PCR检测技术建立及初步应用

根据GenBank公布的鸡毒霉形体、猪肺炎霉形体、猪滑液霉形体和絮状霉形体的16s rRNA基因序列,利用引物设计软件DNAStar和Primer5.0自行设计3对特异性引物,以市场上常见的兽用疫苗为检测对象进行试验,优化反应体系,建立了兽用疫苗霉形体污染检测的套式PCR方法。同时,本试验还对市场上的兽用疫苗进行随机抽查检测,其检出率分别为24.2%(23/95)、21.1%(20/95)和14.7%(14/95)。

猪支原体肺炎活疫苗(RM48株)的最小免疫剂量测定及活菌滴度与免疫保护率平行关系试验

为确定猪支原体肺炎活疫苗(RM48株)的最小免疫剂量,使用两批该疫苗(活菌滴度均为108CCU/m L)分别用原倍、10倍、100倍和1000倍稀释,以胸腔注射和鼻腔接种两种方式各免疫4头仔猪,45 d后攻毒,70 d后剖杀观察结果。结果表明其中一批疫苗4个稀释度胸腔注射组的攻毒保护率分别为78%、77.6%、68.8%和55.2%,鼻腔接种组分别为70.6%、68.1%、58.4%和18.4%;另一批的胸腔注射组攻毒保护率分别为80.6%、78.8%、67.6%和52.4%,鼻腔接种组分别为71.6%、68.4%、53.5%和28.4%。按照判定标准,可将该疫苗的胸腔注射接种最小免疫剂量确定为106CCU/头,鼻腔接种最小免疫剂量确定107CCU/头,同时结果也证明免疫保护率与活菌滴度间在测定范围内具有很好的平行关系。

雾化对猪支原体肺炎活疫苗活力的影响

为研究经喷雾器雾化对活疫苗微生物学活性的影响,用变色单位(CCU)法分别对经过不同压力雾化前后的猪支原体肺炎活疫苗活力进行测定,结果表明,喷雾器在雾化过程中的切割力能显著降低疫苗的活力。喷雾器喷射压力越大,对疫苗活力下降的影响越大。

皂树皂苷QS21增强猪支原体肺炎活疫苗滴鼻免疫小鼠效果评价

为提高猪支原体肺炎活疫苗的滴鼻免疫效果,以猪支原体肺炎(168株)活疫苗为抗原,以QS21为免疫佐剂混合后滴鼻免疫小鼠,ELISA法检测免疫效果,包括血清和支气管肺泡灌洗液中抗原特异性抗体水平,并测定了Th1型细胞因子IFN-γ、Th2型细胞因子IL-4和Th17型细胞因子IL-17的分泌情况。结果表明,QS21能激活黏膜和全身性的体液免疫,升高血清和支气管肺泡灌洗液中IgG,IgG1、IgG2a抗体含量,并能提高支气管肺泡灌洗液中黏膜免疫抗体s IgA的含量。QS21还能显著增加支气管肺泡灌洗液中IL-4、IFN-γ和IL-17的分泌,激活Th1、Th2和Th17型细胞免疫应答。以上结果表明QS21能有效激活免疫系统,提示QS21可作为猪肺炎支原体活疫苗的候选黏膜佐剂。

鸡滑液囊支原体疫苗研究进展

鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是引起家禽支原体病的主要病原菌之一,引起家禽的腱鞘炎、气囊炎和关节肿胀等,降低生产性能,给我国养禽业造成了巨大的经济损失。使用高免疫保护力的滑液囊支原体疫苗是防控该病的重要手段之一。文章将现有的鸡滑液囊支原体疫苗使用及研发情况,包括弱毒疫苗、灭活疫苗和基因工程亚单位疫苗进行综述,阐述了其优缺点,并对未来鸡滑液囊支原体疫苗的研发方向进行了展望,以期为研发更加有效的鸡滑液囊支原体新型疫苗提供借鉴和参考。

新支二联活疫苗免疫与鸡滑液囊支原体感染相关性研究

为了解新支二联活疫苗和鸡滑液囊支原体之间有无相互影响,选用100只1日龄SPF鸡随机分为5组,每组20只,进行比对试验。其中G1和G2组免疫新支二联苗活疫苗,G2组在疫苗免疫7 d后MS攻毒,G3、G4和G5组分别为IBV攻毒组,MS攻毒组及阴性对照组。免疫21 d后进行ND血清抗体检测,26 d后剖检进行气囊评分,气管MS和IBV再分离及病理观察。结果显示,G1和G2组ND抗体阳性率分别为94.11%和94.73%;G2和G4组出现气囊病变数量均为16只,气管MS再分离阳性数分别为18只和20只;气管IBV再分离结果显示,G1和G2组新支二联苗的保护率分别为88.24%和89.47%;气管病理学观察显示G3组出现了典型的传染性支气管炎病理变化,而G1组和G2组未出现明显IB病理变化,但G2组与G4组均有轻微的MS病理变化。新支二联苗免疫后7 d感染MS不影响疫苗的免疫效力,新支二联苗免疫不会加剧MS感染的致病性。本研究通过SPF鸡动物试验,探讨商品化新支二联活疫苗与MS的相互作用。

母源抗体对雏鸡接种鸡毒支原体活疫苗免疫力的影响

对接种过和未接种过ＭＧ活疫苗母鸡的４日龄仔鸡进行疫苗接种。一个月后，以强毒Ｒ株攻击。根据在１４日后剖杀仔鸡的气囊病变，说明不论母鸡是否经过免疫接种，其仔鸡都可产生良好的免疫应答，两组仔鸡分别有７８．４％和８５．７％得到保护。

细胞和病毒活疫苗中支原体污染的PCR检测方法建立与应用

【目的】在生物学研究及生物制品生产中易发生支原体污染,针对我国当前支原体检验方法在时效性和敏感性上的不足,建立一种简便快速、特异敏感的支原体检验PCR方法。【方法】从SILVA数据库下载包含全部细菌、古菌和真菌的核糖体rRNA小亚基(16S/18S, SSU)参考序列的库文件SILVA_123_SSURef,从中提取全部支原体序列,经去重复后得到181条(种)支原体(包括139个已分类的单一种类和42个未分类的支原体)的16S rRNA序列,经比对后选取高变区V6到V9为检测目标区段,设计筛选出表现最佳的检测引物,建立检测支原体的通用PCR方法。选取12种常见的支原体或2种甾原体作为待检样品对该PCR方法进行检测范围验证;取6种不同动物来源的常用传代细胞和3种常见细菌进行特异性验证;选取了5种最常见的支原体和1种甾原体进行敏感性试验;并将其与经典培养法一同对17批(种)动物病毒活疫苗(分别用于6种动物)和24份8种细胞培养物样本进行对比检测以评价其实际应用效果。【结果】建立了一种通用的支原体PCR检测方法,检测引物由2条上游引物(5′-GCAAARCTATRGARAYATAGYVGAG-3′和5′-GCAAAGGCTTAGAAATAAGTTCGGAG-3′)和1条下游引物(5′-CCARCTCYCATRGTKTGACGG-3′)组成,引物配比为3﹕1﹕4,最佳退火温度为56℃。采用该PCR方法对14个较常见的支原体种类进行检测,结果均能扩增出396—413 bp大小的特异性条带,表明该方法的检测范围符合检测要求;对6种动物传代细胞和3种常见细菌进行检测,结果均未扩增出特异性条带,表明其特异性良好;灵敏度测定结果表明该PCR方法的检测下限可达20—200 CCU的活菌,对应的核酸为1.5—15.0 pg;对共计17批病毒活疫苗和24份细胞样品的检测结果与培养法检测结果基本一致,表明本研究建立的支原体PCR检测方法与培养法有很好的一致性,而且敏感性更高。【结论】建立的支原体PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好、简单快速,为细胞及病毒活疫苗中可能的支原体污染提供了一种准确可靠的快速检测方法。