Myf6基因在不同地方鸡种早期生长发育中的表达分析

为了探究Myf6基因在京海黄鸡和金茅黄鸡体内的差异表达规律,研究其在两个品种鸡中可能发挥的作用机制,试验采用实时荧光定量PCR技术对Myf6基因在不同品种鸡不同组织中的表达情况进行了检测。结果表明:京海黄鸡和金茅黄鸡公母鸡胸肌和腿肌中的Myf6基因相对表达量均比较高,且极显著高于脾脏(P<0.01);京海黄鸡心脏组织中的Myf6基因相对表达量显著高于脾脏(P<0.05),金茅黄鸡心脏组织中的相对表达量极显著高于脾脏(P<0.01);两个品种鸡的其余组织中Myf6基因相对表达量与脾脏相比差异不显著(P>0.05)。京海黄鸡公母鸡胸肌和腿肌组织中Myf6基因的表达规律基本一致,仅在4周龄胸肌组织中有稍微下降的趋势,但总体上呈现上升的趋势;腿肌组织中的相对表达量比较稳定,从0周龄到16周龄呈现上升趋势,16周龄时达到最高水平。金茅花鸡公母鸡胸肌和腿肌组织中Myf6基因的相对表达量从0周龄到4周龄呈上升趋势,8周龄有稍微下降的趋势,之后又呈现上升的趋势。在两个品种中,无论是公鸡还是母鸡,胸肌中Myf6基因的相对表达量始终显著高于腿肌(P<0.05)。说明Myf6基因参与了肌肉的生长发育,并且发挥了不可替代的作用。

牛myf6基因克隆及在成纤维细胞中的表达

克隆了牛的myf6基因并构建真核表达载体pIRES2-EGFP-myf6,用脂质体技术转染鲁西黄牛成纤维细胞,通过G418筛选出稳定转染的细胞株,利用Western印记、Real-time PCR技术检测myf6对成纤维细胞的影响。结果表明,与对照组相比,稳定转染后的成纤维细胞myf6蛋白和mRNA的表达量提高(P<0.01),肌肉肌酸激酶基因mRNA表达量升高(P<0.05),肌球蛋白轻链基因的mRNA表达量也提高(P<0.01)。细胞形态观察显示转染后的成纤维细胞未融合为肌管。由此可知,牛myf6基因可以在成纤维细胞中表达并且有促进成纤维细胞向肌肉细胞分化的功能。

鸡Myf6基因遗传多态性及其遗传效应研究

采用测序和单链构象多态(SSCP)的方法分析了Myf6基因在5个优质肉鸡纯系和3个杂交配套系中的遗传分布、遗传变异及群体杂合性等群体遗传信息,并分析了Myf6基因对胴体性状及肉质性状的遗传效应。结果发现该基因的CDS区域非常保守,仅在外显子1的47位处发生点突变由G→A,由于人工选育的原因,该基因不同基因型的分布在2个优质肉鸡纯系中偏离了Hardy-Weinberg平衡,并且杂合度较低,遗传一致性较高,但在3个杂交配套系中仍都服从Hardy-Weinberg平衡,杂合度较高,达到了配套杂交的目的。野生型A基因可显著地提高活重、屠体重、胸肌重和腿肌重(P<0.05),同时也会降低肉的嫩度。具体地讲,A基因对增加活重、屠体重、胸肌重和腿肌重的加性效应值分别为45.54g,41.03g,6g和9.775g;对增加肌纤维直径和肌纤维密度的加性效应值分别为1.025μm和-29.99mm2。

巴美肉羊、小尾寒羊Myf6基因多态性及其与肉质的相关性研究

实验采用聚合酶链式反应-单链构象多态(PCR-SSCP)方法对102只巴美肉羊、56只小尾寒羊的Myf6基因片段进行多态性检测,分析Myf6基因多态性与肉质的相关性。巴美肉羊和小尾寒羊在Myf6基因片段上共检测到2种基因型AA和AB型,它们的基因型频率分别为0.63、0.37和0.38、0.62;A、B的等位基因频率分别为0.81、0.19和0.69、0.31;多态信息含量分别为0.26和0.34,属中度多态。在巴美肉羊群体中,AA型,AB型的肉质指标无显著差异;在小尾寒羊群体中,小尾寒羊Myf6的AA型与AB型在背最长肌处的红度值存在显著性差异(p<0.05)。

牦牛Myf6基因克隆及生物信息学分析

本试验旨在克隆牦牛Myf6基因,进行生物信息学分析并探究其在牦牛不同时期的表达情况。以青海雪多牦牛为研究对象,通过设计引物对其Myf6基因CDS区进行克隆测序,运用生物信息学软件对其功能结构进行预测研究。结果显示,牦牛Myf6基因含有一个大小为729 bp的开放阅读框(ORF),编码242个氨基酸。同源性比对和进化树分析结果表明,牦牛Myf6氨基酸序列与普通牛、绵羊亲缘性最近。对Myf6蛋白理化性质进行预测分析得到其结构式为C1167H1870N336O372S13,理论等电点为5.64,其中丝氨酸含量最高,其次是亮氨酸、谷氨酸、脯氨酸和精氨酸;其疏水平均值为-0.586,亲水性最强为-2.467,疏水性最强为1.511,为亲水性、可溶性蛋白;有可形成卷曲螺旋部位;磷酸化位点预测其有26个丝氨酸激酶,10个苏氨酸激酶,5个酪氨酸激酶;亚细胞定位分析其编码产物在细胞核中分布最多(73.9%),其次为细胞骨架(13.0%)、细胞质(4.3%)、高尔基体(4.3%)、分泌系统小泡(4.3%)。蛋白质二级结构主要由无规则卷曲(49.17%)组成,其次是α-螺旋(33.47%)、延伸连(11.57%)及β-折叠(5.79%)。蛋白功能分析显示其生长因子功能几率较大(7.694),其次为转录调节作用,预测其作为一种生长因子参与机体生物学调控。实时荧光定量PCR结果显示,Myf6基因在胎牛、6月龄、4~5岁牦牛背最长肌中均有表达,且在6月龄的表达量显著高于胎牛和4~5岁牦牛(P<0.05)。上述结果为研究牦牛Myf6生肌因子提供了重要的研究数据,为改良牦牛经济性状提供了参考。

miR-374b及其靶基因Myf6调控成肌细胞增殖分化的研究

本实验旨在研究miR-374b及其靶基因Myf6调控肌细胞增殖分化的作用机制。首先采集70日龄胎羊,培养成肌细胞并诱导分化成肌管,通过荧光定量PCR测定诱导分化时期(0、24、72、120 h)miR-374b、Myf6基因以及成肌细胞增殖标志基因MyoD和分化标志基因MyoG、MyHC在mRNA水平的表达量;通过转染miR-374b过表达载体(mimics)及抑制载体(inhibitor),研究各基因在细胞中mRNA水平的表达规律;采用蛋白免疫印迹技术检测Myf6基因在细胞中蛋白水平表达变化规律。结果表明:细胞在分化第72、120小时出现大量肌管,诱导分化成功;miR-374b的表达趋势为先上升后下降,细胞增殖标志基因MyoD在细胞增殖期(0 h)表达量较高;分化标志基因MyHC、MyoG及Myf6基因在细胞增殖期表达量较低,进入分化阶段后表达量极显著上调;转染miR-374b过表达载体(mimics)后,miR-374b表达量极显著高于阴性对照组,而Myf6基因、MyHC基因表达量极显著低于阴性对照组;Myf6基因蛋白表达量极显著低于阴性对照组;转染miR-374b抑制载体(inhibitor)后,miR-374b表达量极显著低于阴性对照组,而Myf6、MyHC、MyoD基因表达量极显著高于阴性对照组;Myf6基因蛋白表达量极显著高于阴性对照组;MyoG基因表达量显著低于阴性对照组。上述结果表明,miR-374b可能通过靶向Myf6基因抑制绵羊成肌细胞分化。

蒙古羊后腿肌肉组织中MYF6和MEF2A基因的甲基化分析

为了分析生肌决定因子(MYF6)和肌细胞增强因子(MEF2A)基因在蒙古羊肌肉组织中的甲基化状态,试验以蒙古羊后腿的8种不同肌肉组织臀中肌、胫骨前肌、股四头肌、趾深屈肌、阔筋膜张肌、腓肠肌、腓骨长肌、半膜肌为材料,采用凝胶电泳技术检验样品DNA的质量,然后用亚硫酸氢盐修饰基因组DNA并对其进行PCR扩增,通过甲基化分析软件对PCR扩增产物的测序结果进行分析以评价各肌肉组织中MYF6和MEF2A基因的甲基化模式。结果表明:不同肌肉组织中MYF6基因均未发生甲基化,而MEF2A基因均发生DNA甲基化,甲基化率均达到100%。说明MYF6和MEF2A基因的甲基化模式在不同肌肉组织之间具有一致性,且根据MYF6基因全部未甲基化、MEF2A基因完全甲基化的结果推测MYF6和MEF2A基因的甲基化并不会对蒙古羊肌肉的形成和分化产生显著影响。

努比亚山羊Myf6基因的克隆及组织表达研究

研究旨在克隆努比亚山羊生肌因子6(Myf6)基因,并对其进行生物信息学分析,检测Myf6基因在努比亚山羊不同组织的表达差异以及努比亚山羊和隆林山羊背最长肌组织的表达差异。以努比亚山羊背最长肌组织cDNA为模板,PCR扩增获得Myf6基因的完整编码区(CDS)后进行菌液验证,并进行序列相似性比对以及系统进化树构建;分析Myf6蛋白理化性质并预测其亲/疏水性,预测蛋白二级结构和三级结构。采用实时荧光定量PCR检测Myf6基因在努比亚山羊心脏、肝脏、脾脏、肾脏、背最长肌、皮下脂肪、瘤胃以及隆林山羊背最长肌中的表达。结果显示,努比亚山羊Myf6基因CDS序列长729 bp,编码242个氨基酸。努比亚山羊Myf6氨基酸序列与绵羊、黄牛、猪、驴、人、小鼠的相似性分别为99.3%、98.8%、94.1%、93.8%、93.4%和89.0%。蛋白理化性质分析结果表明,山羊Myf6蛋白的分子质量为26.98 ku,为不稳定酸性蛋白;亲疏水性分析发现,该蛋白为亲水蛋白;跨膜结构和信号肽预测结果发现,该蛋白不含有跨膜结构和信号肽,不属于跨膜蛋白和分泌蛋白;二级结构预测结果显示,该蛋白主要由无规则卷曲(49.59%)构成,其次为α-螺旋(33.88%)、延伸链(9.50%)和β-转角(7.02%),三级结构预测结果与二级结构一致。实时荧光定量PCR结果显示,Myf6基因在努比亚山羊背最长肌的表达量最高,显著高于其他组织(P<0.05),在肾脏的表达量最低,但与心脏、肝脏、脾脏、皮下脂肪、瘤胃等差异均不显著(P>0.05);对比努比亚山羊和隆林山羊背最长肌的Myf6基因的表达情况发现,努比亚山羊的表达量显著高于隆林山羊(P<0.05)。试验为进一步揭示Myf6基因在肌肉分化中的作用提供了参考。

高邮鸭和金定鸭发育早期骨骼肌MyoG和Myf 6基因的表达分析

【目的】研究生肌调节因子肌细胞生成素(MyoG)和生肌决定因子(Myf 6)基因表达对鸭胚胎期及初生早期骨骼肌发育的影响。【方法】采用Real-time PCR方法研究MyoG、Myf6基因在不同鸭品种(高邮鸭和金定鸭)胚胎期(13,17,21,25,27胚龄)及初生早期(出雏后7日龄)骨骼肌发育中的表达差异,并分析其表达变化与胸、腿肌发育的相关性。【结果】MyoG和Myf6基因在2个品种鸭胸肌、腿肌组织发育早期均有表达,但不同组织存在不同的表达模式。MyoG在鸭胚胸肌、腿肌组织中均呈现"前高后低"的表达模式,21胚龄以前表达量相对较高,随后表达量下降,并维持相对较低水平;而Myf6基因在胸肌组织中在21胚龄时表达量最高,随后表达量下降,但仍维持相对较高的表达水平;在腿肌组织中在13胚龄时表达量较高,在17胚龄时达到最高,随后表达量有所降低,并在21胚龄后急速下降至极低水平,但其表达在胚胎期后期(27胚龄)以及初生期(7日龄)又有缓慢上升趋势。二元变量相关性分析结果表明,2个品种鸭胸肌、腿肌MyoG mRNA表达与胸肌、腿肌发育呈强负相关;胸肌中Myf6mRNA的表达与胸肌发育无显著相关性,腿肌中Myf6mRNA的表达与腿肌发育呈强负相关。【结论】骨骼肌中MyoG和Myf6基因表达具有显著的时空性,性别差异不显著,骨骼肌中MyoG和Myf6基因表达与鸭发育早期骨骼肌质量变化呈现负的线性相关。