SR9009联合吲哚丙酸通过核因子κB信号通路减轻C2C12成肌细胞的炎症反应

背景:钟基因Rev-erbα参与调节炎症,但激活Rev-erbα会增加心脑血管疾病风险。为降低相关风险,探索Rev-erbα激动剂SR9009联合其他药物来减轻骨骼肌成肌细胞炎症,奠定治疗炎症相关性骨骼肌萎缩的理论基础。目的:探讨脂多糖刺激C2C12成肌细胞时吲哚丙酸、SR9009与核因子κB信号通路的关系。方法:①1μg/mL脂多糖刺激C2C12成肌细胞,RNA转录组测序结合KEGG通路富集分析信号通路。②CCK-8法检测C2C12成肌细胞活性,筛选吲哚丙酸的最佳给药浓度;然后将细胞分为空白对照组、脂多糖(1μg/mL)组、SR9009(10μmol/L)+脂多糖组、吲哚丙酸(80μmol/L)+脂多糖组、吲哚丙酸+SR9009+脂多糖组,ELISA检测细胞上清液中白细胞介素6水平,RT-qPCR检测白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、Toll样受体4、CD14 mRNA表达,Western blot检测NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达。③siRNA敲减Rev-erbα,RT-qPCR评估敲减效率,检测白细胞介素6、肿瘤坏死因子αmRNA表达。结果与结论:①与空白对照组比较,脂多糖时间依赖性抑制成肌细胞融合形成肌管,白细胞介素6、肿瘤坏死因子αmRNA表达水平升高,细胞上清液中白细胞介素6水平显著升高;KEGG通路分析支持脂多糖刺激激活核因子κB信号通路。②吲哚丙酸浓度>80μmol/L时抑制C2C12成肌细胞活性;吲哚丙酸和SR9009通过抑制核因子κB信号通路发挥抗炎作用,降低白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、Toll样受体4、CD14 mRNA表达水平,p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达比值低于脂多糖组。SR9009联合吲哚丙酸显著降低脂多糖诱导的炎症,Toll样受体4、CD14、白细胞介素6和肿瘤坏死因子αmRNA表达水平进一步下调,p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达比值显著低于吲哚丙酸+脂多糖组和SR9009+脂多糖组。③Rev-erbα随脂多糖刺激时间依赖性升高;siRNA敲减Rev-erbα效率达58%以上,成功敲减Rev-erbα后添加脂多糖,白细胞介素6和肿瘤坏死因子αmRNA表达较脂多糖组显著上调。④结果说明,Rev-erbα可以作为调节炎症反应的靶点,SR9009靶向激活Rev-erbα联合吲哚丙酸能抑制核因子κB信号通路显著减轻C2C12成肌细胞的炎症反应,联合抗炎效果优于单独干预。

叶酸通过JNK/p38 MAPK信号通路调节小鼠C2C12成肌细胞分化

目的:观察叶酸(folic acid,FA)对小鼠C2C12成肌细胞增殖和分化的影响并探讨其作用机制。方法:(1)在小鼠C2C12成肌细胞增殖阶段,采用不同浓度(0、2.5、5、10和20μmol/L)的FA处理C2C12细胞,显微镜下观察各组细胞的状态,MTT法检测细胞活力,EdU法检测细胞增殖情况。(2)在小鼠C2C12成肌细胞分化阶段,将细胞分为对照(control,Ctrl)组(0μmol/L FA)和FA组(10μmol/L FA),于分化的第2天和第4天,采用免疫荧光染色和Western blot检测成肌细胞分化相关蛋白成肌细胞决定蛋白1(myoblast determination protein 1,MyoD)、成肌蛋白(myogenin,MyoG)和肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyHC)的表达水平,并统计各组细胞肌管形成情况。(3)在小鼠C2C12成肌细胞分化第4天时,加入FA处理0、1、3和6 h,采用Western blot检测各时点c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、磷酸化JNK(phosphorylated JNK,p-JNK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和磷酸化p38 MAPK(phosphorylated p38 MAPK,p-p38 MAPK)蛋白水平。(4)将分化4 d的小鼠C2C12成肌细胞分为Ctrl组、FA组、SP600125(JNK特异性抑制剂)组、SB2035805(p38 MAPK特异性抑制剂)组、FA+SP600125组和FA+SB203580组。C2C12成肌细胞先接受10μmol/L的SP600125或SB203580处理1 h,再经10μmol/L的FA处理24 h,FA组经10μmol/L FA处理24 h,Ctrl组不作处理。采用Western blot检测p-JNK、JNK、p-p38 MAPK、p38 MAPK和MyHC蛋白水平。结果:(1)与0μmol/L FA组相比,其余各浓度组的细胞数量明显增多,细胞活力显著提高(P<0.05),EdU阳性细胞率均显著增加(P<0.05)。(2)与Ctrl组相比,FA组MyoD、MyoG和MyHC的表达水平均显著提高(P<0.05),肌管融合指数显著增加(P<0.05或P<0.01)。(3)与0 h组相比,FA处理1、3和6 h后p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK的比值均显著升高(P<0.05或P<0.01),且随着处理时间的延长,p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK的比值呈现逐渐升高的趋势。(4)与Ctrl组相比,FA组p-JNK、p-p38 MAPK和MyHC蛋白水平显著升高(P<0.01);与FA组相比,FA+SP600125组p-JNK和MyHC蛋白水平显著降低(P<0.05),FA+SB203580组p-p38 MAPK和MyHC蛋白水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论:FA可以通过激活JNK/p38 MAPK信号通路促进小鼠C2C12成肌细胞分化。

小麦肽对小鼠成肌细胞C2C12凋亡的影响及机制研究

目的:采用小鼠成肌细胞C2C12探究小麦肽对其增殖和凋亡的影响,并探明可能的作用机制。方法:CCK-8法检测小麦肽组C2C12和对照组C2C12的增殖和凋亡指数,采用高通量转录组测序进行差异表达分析,通过STRING分析构建差异基因的蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络,经Cytoscape可视化,探究C2C12中受小麦肽影响的潜在靶标基因及其功能。结果:5mg/mL小麦肽组抑制细胞凋亡较对照组差异显著(T>1.67,P<0.05)。相较对照组,小麦肽组C2C12中鉴定出370个差异基因,上调基因表达109个、下调基因表达261个,FC≥3/2or≤2/3。经分析,上调基因表达主要富集于炎症响应、免疫响应、TNF信号通路和IL-17信号通路等相关通路,下调基因表达主要富集于氧化还原过程等相关通路,PPI互作参数interactionscore≥0.7。从PPI的差异基因中得到前10个hub基因,并筛选到趋化因子CXCL1、CCL5、CCL2、CXCL5、CXCR4、Il6、MMP3。经分析,hub基因倾向于在趋化因子介导的信号通路、细胞对趋化因子的反应和趋化因子的反应作为生物学过程方面富集,其中趋化因子CXCL1、CCL2、CCL5基因与C2C12相关。结论:本研究揭示小麦肽可促进C2C12增殖,抑制细胞凋亡。并且小麦肽通过调节CXCL1、CCL5、CCL2、CXCL5、CXCR4等趋化因子表达,抑制成肌细胞的凋亡。

体外诱导C2C12细胞向成骨细胞的分化

目的成骨细胞特异性转录因子a1(core binding factor a1,Cbfa1)通过调节生长因子和骨特异性细胞外基质蛋白的基因表达而参与成骨细胞的分化和骨发育过程。文中构建成Cbfa1,以腺病毒载体转染成肌细胞C2C12,为种子细胞构建组织工程化骨。方法体外培养小鼠成肌细胞C2C12,用重组腺病毒质粒pAd-IL-31介导Cbfa1/Osf2基因瞬时转染小鼠成肌C2C12细胞,Western blot检测Cbfa1蛋白表达。结果 Cbfa1蛋白表达、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性测定、骨钙素(osteocalcin,OCN)分泌量以及茜素红染色感染组明显高于对照组。结论成肌细胞C2C12可以作为种子细胞构建组织工程化骨。

“神舟10号”空间飞行对骨骼肌C2C12成肌细胞可塑性的影响

目的研究空间飞行对骨骼肌C2C12成肌细胞增殖和分化可塑性的影响。方法利用"神舟10号"飞船(Shenzhou-10,SZ-10)舱内环境,开展空间细胞学实验,并在地面同步模拟空间舱环境进行实验。进行天基与地基实验细胞的同步活细胞影像监测和细胞固定,天基实验细胞返回后与地基细胞同步开展细胞影像与免疫细胞化学的对比分析。结果 1)活细胞影像监测提示,与地基培养细胞相比,天基细胞培养48 h单核细胞(增殖)减少,且96 h仅见地基培养细胞中出现多核肌管(分化)。2)免疫细胞化学分析表明,地基细胞48 h增殖标志蛋白Myo D表达显著增加,96 h有所下降,而天基培养细胞Myo D表达均显著减少;3)地基实验中48 h细胞开始融合分化,中间结蛋白Desmin阳性单核细胞数目明显增加,但在分化96 h后,Desmin阳性单核细胞数目减少,而3个核以上的肌管明显粗大且数目较多;而天基细胞48 h虽有Desmin阳性单核细胞,但比地基阳性细胞数目明显较少,分化96 h后肌管融合率(约30%)比地基96 h(约78%)显著减少。结论空间飞行期间骨骼肌成肌细胞增殖分化的可塑性显著降低,这可能参与了空间飞行中失重性肌萎缩的形成。

中胚叶叉头-1在骨成形蛋白-2诱导肌胚细胞C2C12转化成骨细胞过程中的作用

为了研究中胚叶叉头 1(MFH 1)基因在骨骼形成和细胞分化中的作用 ,利用基因重组、杂交瘤技术制作MFH 1单克隆抗体 ,利用蛋白质印迹和RNA印迹分析观察了骨成形蛋白 2 (BMP 2 )诱导小鼠肌胚细胞C2C12表达MFH 1、产生碱性磷酸酶和骨钙蛋白 .小鼠肌胚细胞C2C12低水平地表达内源性MFH 1蛋白以及导入小鼠MFH 1cDNA的人膀胱癌细胞HTB9也表达小鼠MFH 1蛋白 ,这种蛋白质定位于细胞核中 .用BMP 2处理后 ,MFH 1蛋白和mRNA在C2C12细胞中的表达显著地增加 .用反义MFH 1序列转染小鼠肌胚细胞C2C12可降低内源性MFH 1水平 ,BMP 2不能诱导导入反义MFH 1序列的肌胚细胞C2C12产生MFH 1蛋白 ,也不能诱导碱性磷酸酶 (ALP)活性和骨钙蛋白量的增加 .结果表明 ,BMP 2诱导的MFH 1蛋白在调节肌胚细胞C2C12向成骨细胞分化方面起关键作用 .

周期性机械拉伸对C2C12成肌细胞增殖的影响

目的:探讨不同的周期性拉伸应变条件对C2C12成肌细胞增殖的影响。方法:周期性拉伸的各种力学条件通过BioFlex加载系统实现,采用应用流式细胞术和BrdU法对拉伸应变下的细胞增殖动力学变化进行分析,反映成肌细胞增殖情况。结果:不同的周期性机械拉伸条件影响C2C12细胞的增殖,拉伸的频率对C2C12细胞增殖有较大的影响。在0.5Hz拉伸频率下,2.5%、5%和10%的细胞变形幅度都不能促进细胞的增殖,其中10%(0.5Hz)的拉伸幅度抑制C2C12成肌细胞的增殖;而在0.125Hz拉伸频率下,10%的细胞变形幅度明显地促进C2C12成肌细胞的增殖。结论:较低的拉伸频率有利于成肌细胞的增殖,高频率的拉伸抑制成肌细胞的增殖。

微小RNA分子miR-21和miR-22对C2C12细胞成肌分化影响的研究

目的探讨微小RNA(microRNAs)分子miR-21和miR-22对于C2C12细胞体外成肌分化进程的影响。方法以C2C12细胞体外成肌分化为模型,Northern blot检测miR-21和miR-22两个分子在分化过程中的表达变化及组织表达谱,转染DNA/LNA杂合体反义链进行loss-of-fuction功能研究,RT-PCR分析其对分化相关分子的影响。结果成功建立C2C12细胞体外成肌分化模型,2个分子在分化过程中均表达上调,且它们具有各自的组织分布特点;建立了以DNA/LNA杂合体反义链为手段的microRNAs研究的loss-of-fuction平台;与对照组比较,抑制这2个microRNAs对于成肌分化相关的骨骼肌α-肌动蛋白、成肌素和MEF-2D等分子的表达没有影响。结论抑制miR-21和miR-22在C2C12细胞成肌分化过程中的上调不影响其分化,说明这2个分子对于分化的进程影响不大。

ShRNA介导的Smad4基因沉默对C2C12成肌细胞纤维化的影响

目的:研究慢病毒介导的Smad4-shRNA对TGF-β1诱导的纤维化进程的影响。方法:(1)设计并选择抑制效能最高的Smad4-shRNA,包装生产慢病毒,转染C2C12成肌细胞,并检测转染后细胞的Smad4表达;(2)根据TGF-β1诱导C2C12成肌细胞向成肌纤维细胞分化的模型,以慢病毒介导的Smad4-shRNA转染细胞,将不同处理的细胞分为A、B、C、D四组,分别为C2C12细胞组、TGF-β1诱导组、C2C12细胞转染组和TGF-β1诱导后转染组。通过荧光Realtime-PCR和Westerblot检测各组collagen I和α-SMA表达水平。结果:(1)慢病毒介导Smad4-shRNA1转染C2C12细胞后,其Smad4 mRNA和蛋白表达显著低于未转染组(P<0.05);(2)TGF-β1诱导组α-SMA和Collagen I mRNA及蛋白表达均显著高于C2C12细胞组(P<0.05);(3)TGF-β1诱导后转染组α-SMA与collagen I mRNA及蛋白表达显著低于TGF-β1诱导组(P<0.05),与C2C12细胞组和C2C12细胞转染组相比则无明显差异(P>0.05)。结论:降低Smad4表达能有效抑制成肌细胞及受TGF-β1诱导成肌纤维细胞的纤维化过程,提示Smad4可能成为拮抗骨骼肌纤维化的靶点。

干扰E2F7对C2C12成肌细胞增殖的影响

【目的】探究转录因子E2F7在骨骼肌细胞发育过程中的作用。【方法】以C2C12成肌细胞为研究对象,通过设计小干扰RNA干扰C2C12成肌细胞中E2F7的表达,分为干扰组和对照组,并利用RT-PCR、CCK-8和EdU等技术检测在C2C12成肌细胞中干扰E2F7后对成肌细胞增殖的影响。【结果】E2F7 mRNA表达水平在C2C12成肌细胞增殖期极显著高于分化期(P<0.01);与对照组相比,干扰组的细胞活率和新生细胞比率皆极显著高于对照组(P<0.01);干扰E2F7显著提升了C2C12成肌细胞中Cyclin E的表达水平(P<0.05),极显著促进Cyclin D和CDK4的表达(P<0.01);并且干扰E2F7可显著促进E2F2 (P<0.05)和极显著促进E2F1及E2F3的表达(P<0.01),同时极显著促进与成肌细胞增殖相关microRNAs (miR-7、miR-25、miR-27和miR-92a)的表达(P<0.01)。【结论】干扰E2F7可促进C2C12成肌细胞的增殖,E2F7可能是通过调控经典E2Fs信号通路和成肌细胞增殖相关microRNA发挥作用。

Reversine对小鼠C2C12成肌细胞增殖与分化作用的初步研究

目的初步探讨Reversine对小鼠C2C12成肌细胞增殖分化的影响。方法体外培养C2C12成肌细胞系.实验第一步分三组:A组:正常对照组,B组:1μM Reversine处理12h组,C组:1μM Reversine处理24h组。上述三组用Annexin-V/PI双染法处理C2C12成肌细胞并用流式细胞仪技术检测三组C2C12细胞凋亡的影响;实验第二步分五组:D组:正常对照组,E组:单独1μM Reversine处理7d,F组:单独成骨诱导7d,G组:1μM Reversine诱导12h+单独成骨诱导7d,H组:1μM Reversine诱导12h+1μM Reversine联合成骨诱导7d。上述五组光镜下观察细胞形态的变化,并通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测五组C2C12成肌细胞分化抑制因子(ID2),肌肉发生调节因子(Myogenin),生肌因子后结蛋白(Desmin)mRNA的表达。结果与A组相比,C组1μM Reversine处理24h能引起C2C12细胞明显的凋亡,B组1μM Reversine处理12h的C2C12细胞未见明显的凋亡。与D组相比,E组和H组的细胞增殖明显受到抑制,F组和G组细胞逐渐增殖并融合。结论 Reversine能够显著的抑制成肌细胞的增殖分化过程。

MyHC基因在C2C12成肌细胞分化过程中的时序表达

以体外培养的C2C12成肌细胞为研究对象,然后利用荧光定量PCR检测肌球蛋白重链(myosin heavy chains,MyHC)的3种亚型MyHC1、MyHC2x和MyHC2b在成肌诱导分化中(0-8 d)中的时序表达规律.结果表明,MyHC1基因在诱导分化的0-4 d表达呈上升趋势,4-8 d又呈下降趋势,在第4 d和第6 d的表达水平显著高于其他天数(p<0.05).MyHC2x基因在诱导分化的0-6 d表达呈上升趋势,但在第8 d又开始下降.MyHC2b在诱导分化的0-8 d中表达一直呈上升趋势,第6 d和第8 d表达水平显著高于其他天数(p<0.05).

共轭亚油酸对C2C12肌细胞生脂和生肌分化的影响

本研究分析了共轭亚油酸(CLA)对C2C12肌细胞生脂转分化和生肌分化的影响。分别培养并诱导C2C12鼠源肌细胞生脂转分化和正常的生肌分化,同时分别使用终浓度为50μmol/L的c9,t11-CLA和t10,c12-CLA处理细胞,并设对照组,取生脂转分化第10天和生肌分化第8天的细胞用于实时定量PCR检测,观察c9,t11-CLA和t10,c12-CLA对C2C12肌细胞不同分化的影响。结果表明:1)与对照组相比,c9,t11-CLA促进了C2C12肌细胞的生脂转分化,显著增加了细胞内甘油三酯(TG)含量(P<0.05),显著上调了细胞内脂肪酸合成酶(FAS)、CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)、过氧化物酶体增殖剂激活受体γ(PPARγ)和脂肪酸结合蛋白4(FABP4)基因的表达水平(P<0.05);与对照组相比,t10,c12-CLA则抑制了C2C12肌细胞的生脂转分化,显著减少了细胞内TG含量(P<0.05),显著下调了细胞内C/EBPα、PPARγ和FA BP4基因的表达水平(P<0.05)。免疫印迹杂交结果显示FAS和FABP4的蛋白质表达水平也发生了与基因表达相一致的变化。2)与对照组相比,t10,c12-CLA抑制了C2C12肌细胞的生肌分化,显著减少了细胞内肌管数/细胞数(P<0.05),显著下调了细胞内肌细胞生成素(MYOG)和成肌分化抗原(MYOD)基因的表达水平(P<0.05);与对照组相比,c9,t11-CLA则显著上调了细胞内MYOG基因的表达水平(P<0.05),对C2C12肌细胞的生肌分化有一定程度的促进作用。免疫印迹杂交结果显示MYOG和MYOD的蛋白质表达水平也发生了与基因表达相一致的变化。以上结果表明,CLA对动物骨骼肌细胞的正常生肌分化和生脂转分化都具有重要的调节作用。

PGC-1α对C2C12成肌细胞增殖的影响

PGC-1α(Peroxisome Proliferators Activated Receptor gamma coactivator 1 alpha)是一种核受体转录辅助激活因子,广泛参与机体的生物氧化和能量代谢活动.本实验以小鼠C2C12成肌细胞为材料,通过转染pc DNA3.1-flag-PGC-1α真核表达载体,并且与转染空载体的实验对照组比较,利用荧光定量PCR检测转染效果,利用MTT比色法检测PGC-1α对成肌细胞增殖的影响;结果显示,PGC-1α在C2C12成肌细胞中被成功超表达,在转染后的2-5 d,转染真核表达载体组与转染空载体组相比,显著抑制细胞增殖(P<0.05),但在第6 d差异不显著.

C2C12成肌细胞诱导肌性分化过程中miR-101a的表达

以C2C12成肌细胞为模型,在分化培养基中诱导C2C12建立体外肌性细胞分化模型。以poly(A)3'-端加尾和实时定量PCR方法研究miR-101a在C2C12细胞分化过程中的表达情况。结果发现,在细胞转入分化培养基进行肌性分化的1-5 d中,miR-101a的表达量逐渐增加,提示miR-101a可能在肌肉发生中发挥调控作用。

干扰Sema7A抑制C2C12成肌细胞的增殖和分化

为研究脑信号蛋白家族(Semaphorins)成员Sema7A对成肌细胞增殖和分化的影响,本文设计并合成了Sema7A基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),用此siRNA转染C2C12成肌细胞.通过Hoechst核染和流式细胞术检测细胞增殖情况,免疫荧光检测肌管的形成情况,realtime qPCR和Western印迹技术检测成肌标记基因的变化.结果显示,干扰Sema7A后,C2C12成肌细胞增殖减慢,处在G2和S期的细胞所占的比例明显下降,而G1期细胞的比例升高.免疫荧光检测结果显示,干扰Sema7A后,肌管的直径及MyHC+细胞所占比例均显著降低.Real-time qPCR和Western印迹结果也显示,肌肉分化标志基因MyoD、MyoG、MyHC的mRNA及蛋白质表达均下降.进一步检测Sema7A受体下游信号通路发现,干扰Sema7A后,其下游信号分子PI3K和AKT的磷酸化水平被下调.以上结果表明,Sema7A可以调节C2C12成肌细胞的增殖和分化,可能是通过其受体作用于PI3K/AKT信号通路实现的,这为进一步研究Sema7A在骨骼肌发育中的作用提供实验基础.

人Sema4C重组腺病毒载体的构建及其在小鼠成肌细胞系C2C12中的表达

利用Ad5腺病毒载体系统构建人Sema4C基因重组腺病毒表达载体并在成肌细胞系C2C12中表达,并初步探讨Sema4C基因在成肌发育过程中的可能作用。利用脂质体介导重组腺病毒载体转染HEK293细胞,包装出完整的腺病毒;将重组腺病毒载体感染C2C12成肌细胞后,利用激光共聚焦显微镜观察发现12h即有绿色荧光表达,24h后绿色荧光蛋白表达最强;流式细胞仪检测病毒的感染效率几乎达100%。WB检测结果表明感染重组腺病毒载体组C2C12细胞Sema4C蛋白的表达量明显高于空载体对照组(P<0.01)。为了进一步观察Sema4C基因对C2C12细胞增殖分化的影响,流式细胞仪检测了病毒感染48h后C2C12细胞的增殖指数,并对感染后诱导分化的C2C12细胞的分化情况进行了观察。结果首次表明,过表达外源性人Sema4C基因不仅能使C2C12细胞的G0/G1期比例增加,细胞的增殖指数下降,同时在分化培养条件下还能促进C2C12细胞肌管的形成。

17β-雌二醇对C2C12细胞钙离子通道作用的研究

目的研究17β-雌二醇对小鼠成肌细胞C2C12细胞钙离子通道的影响,探讨7β-雌二醇对C2C12细胞的作用。方法应用全细胞膜片钳技术记录不同浓度的17β-雌二醇作用下C2C12细胞钙离子通道的变化。结果67%的C2C12细胞可记录到钙离子电流。在不同浓度17β-雌二醇的作用下,30 mol.L-1组及20 mol.L-1组可引起C2C12细胞钙离子电流明显增大(P<0.05),而10 mol.L-1组则无显著改变。结论17β-雌二醇可通过促进C2C12细胞钙离子通道开放参与对C2C12细胞的调节作用。

miR-143-3p促进C2C12成肌细胞分化

MicroRNAs(miRNAs)是一类小非编码RNA,近年研究发现其在骨骼肌发育调控中发挥重要作用.为探明miR-143-3p在C2C12成肌细胞分化中的调控作用,采用real-time PCR检测了miR-143-3p在小鼠各组织及C2C12成肌细胞分化过程中的表达;使用miR-143-3p的模拟物和特异性抑制剂分别处理细胞,采用real-time PCR和Western印迹分别检测成肌因子MyoG和成肌标志基因MyHC mRNA和蛋白水平的变化;用免疫荧光染色的方法观察肌管的形成.结果显示,miR-143-3p在小鼠各组织中均有表达,并且随着细胞分化表达量逐渐增加;C2C12成肌细胞过表达miR-143-3p,与对照组相比,成肌调控因子MyoG和成肌标志基因MyHC的mRNA和蛋白表达均显著升高,肌管数量明显增多;抑制剂处理结果显示,细胞分化被显著抑制.检测miR-143-3p对MyHC各亚型表达的影响发现,miR-143-3p表达的变化并不直接影响MyHC各亚型的表达.以上结果说明,miR-143-3p在骨骼肌和成肌细胞中均有表达,能够促进C2C12成肌细胞分化,但并不直接调控MyHCs的表达.

铅导致C2C12成肌细胞的氧化应激和凋亡损伤

通过细胞毒性实验、氧化应激检测和凋亡检测，研究醋酸铅（1ead acetate）对C2C12成肌细胞的毒性机理，结果表明，醋酸铅（10~200μmol／L）呈剂量依赖模式显著增加C2C12成肌细胞的乳酸脱氢酶（LDH）释放量、上调活性氧（ROS）、下调过氧化氢酶（CAT）活力，导致胞内DNA损伤严重，流式细胞仪检测细胞周期结果显示高剂量醋酸铅处理细胞48h后，出现凋亡峰；蛋白印迹结果显示，与正常组相比，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调、促凋亡蛋白Bax表达上调、Caspase-3酶活力上调，综上结果表明醋酸铅导致的细胞毒性可能与氧化应激和凋亡损伤相关．