东海贻贝抗菌肽Myticin A基因的克隆表达及其生物学活性

目的:在毕赤酵母表达系统中表达贻贝抗菌肽Myticin A并检测其生物学活性。方法:提取贻贝总mRNA,逆转录合成cDNA,PCR扩增得到DNA片段。PCR产物与pMD18 T连接,得到阳性重组载体pMD18 Myticin A。Myticin A基因插入载体pPIC9K中,得到的重组载体pPIC9K Myticin A转化至宿主菌中。得到高抗性阳性菌株并进行诱导表达。发酵上清进行Tricine SDS PAGE分析并用CM sepharose柱和Sephadex G 25柱纯化,Western印迹法鉴定并检测生物学活性。结果:获得重组载体pPIC9K Myticin A。高抗性多拷贝阳性表达菌株GS115/pPIC9K Myticin A经甲醇诱导后,Tricine SDS PAGE证实其相对分子质量为4 500,表达量为14%以上,纯化后纯度达到90%以上。Western印迹法证实所表达样品为Myticin A。表达样品对巨大芽胞杆菌的生长有抑制作用,对小鼠成纤维细胞(L929)、胰腺癌细胞(SW1990)、结肠腺癌细胞(LoVo)的生长均有明显抑制作用。结论:应用毕赤酵母表达系统能较好地表达抗菌肽Myticin A,生物学活性研究证实其具有抗革兰阳性菌作用,明显抑制肿瘤细胞生长。

厚壳贻贝抗菌肽mytilin和myticin的cDNA基因的克隆与序列分析

抗菌肽是贻贝免疫系统中的一个重要组成部分,也是目前海洋生物抗菌肽研究的重要内容。在贻贝抗菌肽家族中,mytilin和myticin是目前贻贝抗菌肽研究中发现成员最多,丰度最高的两个家族,在贻贝免疫系统中占有重要的地位。为了解厚壳贻贝抗菌肽mytilin和myticin的基因组成及其多样性机制,通过设计特异性引物,以厚壳贻贝血细胞cDNA文库为模板进行PCR扩增以筛选文库,共克隆到8条mytilin的同源cDNA序列和9条myticin的同源cDNA序列,并对其基因序列及推导的氨基酸序列进行了序列比对和变异位点初步分析。上述研究为将来深入研究厚壳贻贝的免疫机制及筛选具有开发价值的抗菌肽分子奠定了理论基础。

A Preliminary Analysis on the Construction and Expression of Eukaryotic Expression Vectors of Mytilin and Myticin from Mytilus coruscus

[Objective] The aim was to study the construction and expression of eukaryotic expression vectors of antibacterial peptides （mytilin and myticin） from Mytilus coruscus.[Method] By the screening of antibacterial peptide genes of mytilin and myticin of Mytilus coruscus,five antibacterial peptide genes were selected.Then,the relative eukaryotic expressing vectors were constructed by the use of PCR technique and DNA recombinant technology.Subsequently,they were transferred in to S78 Saccharomyces cerevisia by using LiAC transformation method,and then preliminary expressing analysis was carried out.[Result] Five eukaryotic expressing vectors of antibacterial peptides from Mytilus coruscus were successfully constructed,and the results of mRNA detection revealed that the five antibacterial peptides from Mytilus coruscus were successfully transcribed.[Conclusion] The results provide a basis for using genetic engineering to express antibacterial peptides of mytilin and myticin from Mytilus coruscus,and for developing the further study of antibacterial peptides from Mytilus coruscus based on this.

厚壳贻贝抗菌肽mytilin和myticin真核表达载体构建及表达的初步分析

[目的]研究厚壳贻贝抗菌肽mytilin和myticin真核表达载体构建及表达。[方法]通过对前期所获得的厚壳贻贝多条mytilin和myticin抗菌肽基因进行筛选,选择其中5条厚壳贻贝抗菌肽基因,采用PCR技术和DNA重组技术构建了相关的真核表达载体,并采用LiAC转化法将其转化到S78酿酒酵母中并进行初步表达分析。[结果]5种厚壳贻贝抗菌肽基因的真核表达载体构建成功,对转化酵母进行mRNA检测结果表明,5种厚壳贻贝抗菌肽的基因在S78酵母中成功转录。[结论]该研究结果为最终采取基因工程手段表达厚壳贻贝抗菌肽mytilin和myticin并在此基础上开展厚壳贻贝抗菌肽的后续研究奠定基础。

贻贝抗菌肽的研究进展

贻贝中存在多种抗菌肽 ,根据一级结构的不同分为 4种 :defensin(防卫肽 )、mytilin、myticin和mytimycin。抗菌肽以前体的形式存在 ,在缺乏感染等刺激物的情况下 ,成熟前体以活性方式储存在血液中 ,当受到感染后便参与组织反应。它们的抗感染反应与哺乳动物吞噬细胞的作用相似 ,不同的抗菌肽具有不同的抗菌谱。抗菌肽是机体在进化过程中非特异性免疫系统中的一种。