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粘细菌Myxococcus sp.CYD-1海藻糖合酶基因克隆及酶学特性分析 被引量:1
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作者 况丹 黄奕晴 +2 位作者 徐嘉 周昊 王飞 《甘肃农业大学学报》 CAS CSCD 2023年第5期227-235,245,共10页
【目的】海藻糖合酶(trehalose synthase,EC.5.4.99.16)可通过转糖苷作用将麦芽糖转化成为海藻糖,该反应仅需一步,且所用原料低廉,在酶法生产海藻糖上显示出一定的应用潜力。本文以粘细菌Myxococcus sp.CYD-1为材料,挖掘新的海藻糖合酶... 【目的】海藻糖合酶(trehalose synthase,EC.5.4.99.16)可通过转糖苷作用将麦芽糖转化成为海藻糖,该反应仅需一步,且所用原料低廉,在酶法生产海藻糖上显示出一定的应用潜力。本文以粘细菌Myxococcus sp.CYD-1为材料,挖掘新的海藻糖合酶资源。【方法】以菌株CYD-1基因组DNA为模板,使用加尾PCR的方法克隆编码海藻糖合成酶的基因MCTs,构建含有组氨酸标签的重组表达载体,并将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达。重组蛋白经Ni^(2+)-NTA纯化,以麦芽糖为底物研究其酶学性质,包括最适温度、最适pH、温度和pH稳定性及金属离子和抑制剂的影响。【结果】从菌株CYD-1基因组中克隆到一个编码海藻糖合成酶的基因MCTs。MCTs全长1659 bp,编码一个552个氨基酸的蛋白,分子量大小为65 kU。氨基酸序列分析表明MCTs与来源于Myxococcus sp.V11的海藻糖合酶相似性为92.36%,与其他已报道的海藻糖合酶有较大差异。MCTs具有高度保守的基序202DAVPYL207,244EANQ247和307RNHDEL312,以及活性中心三联体Asp202-Glu244-Asp310,三维建模结果显示MCTs的催化结构域具有典型的(α/β)8桶状结构,表明MCTs归属于糖苷水解酶GH13家族。重组蛋白在E.coli BL21(DE3)中大量可溶性表达后,通过Ni^(2+)-NTA将目的蛋白纯化至电泳纯。重组酶rMCTs最适反应温度为40℃,最适反应pH为6.5,最大比活力为105.6 U/mg。重组酶rMCTs在30℃下处理4 h,残留酶活为50%,但在65℃下处理1.5 h活力丧失。重组酶rMCTs在pH 5.0~8.0范围内有活性,在pH 6.0~7.5处理12 h活力稳定。1 mmol/L Ca^(2+)对重组酶rMCTs有轻微的激活作用,Co^(2+)、Fe^(3+)、Cu^(2+)对重组酶rMCTs有抑制作用,其余金属离子对酶活力无影响。甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂和SDS对重组酶rMCTs有强烈的抑制作用,TritonX-100对rMCTs酶活力无显著影响。【结论】MCTs具有潜在的应用价值,丰富了海藻糖合成酶资源。 展开更多
关键词 myxococcus sp.CYD-1 海藻糖合酶 基因克隆 酶学特性
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定点突变鉴定Myxococcus sp.V11麦芽糖基海藻糖水解酶MTHase的催化中心
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作者 陈允妲 李雪亮 +4 位作者 吴映函 赵晓艳 吴晓玉 王飞 陈金印 《江西农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期190-197,共8页
【目的】麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)是一种水解与α-1,1糖苷键相邻的α-1,4糖苷键,生成麦芽寡糖和海藻糖,是以淀粉为底物生产海藻糖工艺中的关键酶。实验室从菌株Myxococcus sp.V11基因组中克隆到麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因并异... 【目的】麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)是一种水解与α-1,1糖苷键相邻的α-1,4糖苷键,生成麦芽寡糖和海藻糖,是以淀粉为底物生产海藻糖工艺中的关键酶。实验室从菌株Myxococcus sp.V11基因组中克隆到麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因并异源表达,通过氨基酸序列分析和三维建模,推测其可能的催化中心氨基酸残基构成。【方法】通过对MTHase上可能存在的3个活性位点D256、E291、D386进行PCR介导定点突变,分别将其突变成为D256A、E291A和D386A。【结果】系统进化树结果表明Myxococcus sp.V11所产MTHase与已报道的Deinococcus radiodurans所产麦芽寡糖基海藻糖水解酶(Maltooligosyltrehalose Trehalohydrolase,DR0464)相似度最高,但仅为49.23%,与已报道的淀粉酶相似度则有较大差异。氨基酸序列比对结果表明MTHase与其它来源的麦芽寡糖基海藻糖水解酶都具有相同的保守序列:GTFTPEG(113-119)、WGYDG(153-157)、ED(291-292)、GLXVXLDXVXNHXGPXGNY(184-202)、DGXRXDA(251-257)、IQNHDQ(382-387)。三联体活性中心(Asp256-Glu291-Asp386)均位于保守区域之内,其中Asp256是亲核试剂,Glu291是酸碱催化的质子供体,Asp386起着维持Glu291稳定构象的作用。以已解析的相似性最高的麦芽寡糖基海藻糖水解酶(PDB ID:2BHU)为模板,在SWISS-MODEL上通过同源建模得到MTHase的三维结构模型。MTHase与2BHU虽然相似性仅为49%,但都具有一个典型GH13家族糖苷水解酶所共有的(α/β)8桶状结构域。三维结构显示MTHase主要由3个结构域构成:催化结构域Domain A(Ala95-Asp316,Gln372-Ser512)形成一个典型的(α/β)_(8)桶状结构,Domain A的中间形成一个裂口,活性中心位于口袋之内;N端结构域(Domain B)主要为β-折叠结构,Domain C也由β-折叠构成,催化三联体Asp256-Glu291-Asp386位于靠近Domain C的位置。MTHase与底物连接的氨基酸残基Gly197,Pro198,Gly200,Asn201,Tyr202,Trp210,Asp316,Asp317,His320,Tyr337,Arg366,Asn390均与2BHU一致。通过定点突变,重组表达和活力测定,结果显示突变子D256A、E291A和D386A均彻底失去了淀粉酶活性。【结论】MTHase的活性中心由D256、E291和D386构成,与底物结合的氨基酸位点决定了其对不同底物的适应性。 展开更多
关键词 myxococcus sp.V11 麦芽寡糖基海藻糖水解酶 定点突变 催化中心
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Determination of the chromosomal position effects for plug-and-play application in the Myxococcus xanthus chassis cells
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作者 Xin-jing Yue Jia-rui Wang +2 位作者 Jun-ning Zhao Zhuo Pan Yue-zhong Li 《Synthetic and Systems Biotechnology》 SCIE CSCD 2024年第3期540-548,共9页
The chromosomal position effect can significantly affect the transgene expression,which may provide an efficient strategy for the inauguration of alien genes in new hosts,but has been less explored rationally.The bact... The chromosomal position effect can significantly affect the transgene expression,which may provide an efficient strategy for the inauguration of alien genes in new hosts,but has been less explored rationally.The bacterium Myxococcus xanthus harbors a large circular high-GC genome,and the position effect in this chassis may result in a thousand-fold expression variation of alien natural products.In this study,we conducted transposon insertion at TA sites on the M.xanthus genome,and used enrichment and dilution indexes to respectively appraise high and low expression potentials of alien genes at insertion sites.The enrichment sites are characteristically distributed along the genome,and the dilution sites are overlapped well with the horizontal transfer genes.We experimentally demonstrated the enrichment sites as high expression integration sites(HEISs),and the dilution sites unsuitable for gene integration expression.This work highlights that HEISs are the plug-and-play sites for efficient expression of integrated genes. 展开更多
关键词 Position effect High expression integration sites(HEISs) myxococcus xanthus Tn-seq
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An upgraded Myxococcus xanthus chassis with enhanced growth characteristics for efficient genetic manipulation
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作者 Weifeng Hu Yan Wang +4 位作者 Xiaoran Yue Weiwei Xue Wei Hu Xinjing Yue Yuezhong Li 《Engineering Microbiology》 2024年第3期62-66,共5页
Myxobacteria are well known for multicellular social behaviors and valued for biosynthesis of natural products.Myxobacteria social behaviors such as clumping growth severely hamper strain cultivation and genetic manip... Myxobacteria are well known for multicellular social behaviors and valued for biosynthesis of natural products.Myxobacteria social behaviors such as clumping growth severely hamper strain cultivation and genetic manip-ulation.Using Myxococcus xanthus DK1622,we engineered Hu04,which is deficient in multicellular behavior and pigmentation.Hu04,while maintaining nutritional growth and a similar metabolic background,exhibits improved dispersed growth,streamlining operational procedures.It achieves high cell densities in culture and is promising for synthetic biology applications. 展开更多
关键词 myxococcus xanthus Operation deficiency Phenotypic optimization CHASSIS Genetic performance
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Myxococcus sp.V11海藻糖合酶TreSⅡ分子改造 被引量:3
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作者 赵晓艳 陈允妲 +3 位作者 章雅倩 吴晓玉 王飞 陈金印 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期79-87,共9页
来源于黏细菌Myxococcus sp.V11的海藻糖合酶(trehalose synthase,EC 2.4.1.245)TreSⅡ可通过转糖苷作用将麦芽糖转化成为海藻糖,在酶法生产海藻糖上显示出一定的应用潜力,但TreSⅡ对热敏感,在60℃保温3h,酶活性丧失,限制了其应用范围... 来源于黏细菌Myxococcus sp.V11的海藻糖合酶(trehalose synthase,EC 2.4.1.245)TreSⅡ可通过转糖苷作用将麦芽糖转化成为海藻糖,在酶法生产海藻糖上显示出一定的应用潜力,但TreSⅡ对热敏感,在60℃保温3h,酶活性丧失,限制了其应用范围。目的:拟探索TreSⅡ影响热稳定性的氨基酸残基构成,通过对可能的氨基酸位点进行定点突变,以期获得耐热性的突变子,扩大TreSⅡ应用范围。方法:通过PCR介导的方法对TreSⅡ可能影响到热稳定性的氨基酸Q3、A283、W374、R449和Y537进行定点突变,以野生型重组酶为对照,比较突变型与野生型的最适反应温度和最适反应pH,通过测定不同温度下保存不同时间后的残留酶活,检测突变子的耐热效果。结果:研究表明突变子Q3D、A283R、W374D、R449Q和Y537H的比酶活与野生型无显著差异,且最适pH和最适反应温度也未发生改变;A283R、Y537H在60℃条件下,3h后活性剩余68%;Q3D、W374D、R449Q在温度60℃时,3h后活性剩余35%。结论:TreSⅡ分子结构中与金属离子结合的几个氨基酸残基的改变对蛋白质分子的耐热性具有显著影响。 展开更多
关键词 myxococcus sp.V11 海藻糖合酶 定点突变 热稳定性
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理性设计和定点突变对提高海藻糖合酶TreSI热稳定性的影响
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作者 张丽霞 黄奕晴 +2 位作者 吴嘉蕾 李元顺 王飞 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期55-62,共8页
[目的]来源于黏细菌Myxococcus sp.V11的海藻糖合酶(trehalose synthase,EC 5.4.99.16)TreSI可通过转糖苷作用将麦芽糖转化成为海藻糖,在酶法生产海藻糖上有很高的应用前景,其热稳定性是制约该酶工业应用的关键。本文旨在通过定点突变对... [目的]来源于黏细菌Myxococcus sp.V11的海藻糖合酶(trehalose synthase,EC 5.4.99.16)TreSI可通过转糖苷作用将麦芽糖转化成为海藻糖,在酶法生产海藻糖上有很高的应用前景,其热稳定性是制约该酶工业应用的关键。本文旨在通过定点突变对TreSI相关氨基酸残基进行改造,以期获得热稳定性强的突变子,提高其应用潜力。[方法]使用在线预测软件PoPMuSiC-2.1对TreSI每个氨基酸突变后的去折叠自由能变化(ΔΔG)进行初步预测,以SDM(site directed mutator)和mCSM(mutation cutoff scanning matrix)以及两者联合(Duet)进行预测。用重叠延伸PCR法构建11个海藻糖合酶突变体,经大肠杆菌表达和蛋白纯化后,对其酶学特性进行表征。[结果]成功筛选到2个热稳定性提高的突变子。突变子R149L、N193E的比酶活与野生型无显著差异,且最适pH值和最适反应温度也未发生改变;R149L、N193E在50℃处理1 h的残余酶活性为野生型的1.37和2.50倍;在60℃处理1 h的残余酶活性为野生型的2.41和4.32倍。[结论]本研究利用PoPMuSiC结合SDM、mCSM模拟的设计策略提高了TreSI的耐热性,为工业应用提供了新的酶资源,也为其他工业酶的定向改造提供了参考。 展开更多
关键词 myxococcus sp.V11 海藻糖合酶 定点突变 热稳定性
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Genetic manipulation and tools in myxobacteria for the exploitation of secondary metabolism 被引量:2
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作者 Xinjing Yue Duohong Sheng +1 位作者 Li Zhuo Yue-Zhong Li 《Engineering Microbiology》 2023年第2期39-56,共18页
Myxobacteria are famous for their capacity for social behavior and natural product biosynthesis.The unique sociality of myxobacteria is not only an intriguing scientific topic but also the main limiting factor for the... Myxobacteria are famous for their capacity for social behavior and natural product biosynthesis.The unique sociality of myxobacteria is not only an intriguing scientific topic but also the main limiting factor for their ma-nipulation.After more than half a century of research,a series of genetic techniques for myxobacteria have been developed,rendering these mysterious bacteria manipulable.Here,we review the advances in genetic manipu-lation of myxobacteria,with a particular focus on the exploitation of secondary metabolism.We emphasize the necessity and urgency of constructing the myxobacterial chassis for synthetic biology research and the exploita-tion of untapped secondary metabolism. 展开更多
关键词 MYXOBACTERIA myxococcus xanthus Genetic manipulation Secondary metabolism EPOTHILONE
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