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变异猪流行性腹泻病毒M和N双基因融合真核表达及其活性鉴定 被引量:4
1
作者 王隆柏 陈秋勇 +3 位作者 吴学敏 陈如敬 车勇良 周伦江 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第12期3083-3089,共7页
【目的】体外表达变异猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M-N双基因融合蛋白并明确其生物活性,为开展PEDV新型疫苗及其诊断技术研究提供更多的候选蛋白。【方法】将变异PEDV的M基因克隆至pEASY-Blunt M2(pM2)真核表达载体构建pM2-M真核质粒,通过... 【目的】体外表达变异猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M-N双基因融合蛋白并明确其生物活性,为开展PEDV新型疫苗及其诊断技术研究提供更多的候选蛋白。【方法】将变异PEDV的M基因克隆至pEASY-Blunt M2(pM2)真核表达载体构建pM2-M真核质粒,通过同源重组将N基因克隆至M2-M基因片段构建pM2-M-N双基因融合重组质粒,然后转染293T细胞表达出M-N双基因融合蛋白。通过Western blotting、ELISA及免疫BLAB/c小鼠试验鉴定表达融合蛋白的生物学活性。【结果】扩增获得的M基因、N基因片段大小分别为678和1359 bp,且与原序列的相似性均达100.0%。将M基因和N基因并连接至pM2真核表达载体成功构建获得pM2-M-N双基因融合重组质粒,M-N双基因片段大小为2004 bp,且与原序列的相似性为99.3%。以pM2-M-N双基因融合重组质粒转染239T细胞,表达出大小约75 kD且具有免疫活性的M-N双基因融合蛋白,纯化的M-N双基因融合蛋白能与PEDV阳性血清反应,与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等病毒均无交叉反应;以其免疫BLAB/c小鼠能诱导产生特异性抗体。【结论】通过pM2真核表达载体能构建获得变异PEDV毒株的pM2-M-N融合双基因重组质粒,转染293T细胞后可表达出具有良好免疫活性的M-N双基因融合蛋白,为后期开展变异PEDV基因工程疫苗及其诊断技术研究提供更多的候选蛋白。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒(PEDV) M基因 n基因 双基因 融合蛋白
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犬瘟热病毒分离株N、H、F蛋白基因的变异分析 被引量:2
2
作者 王旭荣 王小辉 +3 位作者 张世栋 李世宏 潘虎 严作廷 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2011年第8期71-77,共7页
通过RT-PCR方法扩增到犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)分离株GS0812-4的N、H、F蛋白基因,然后克隆入pGEM-T Easy载体并进行序列分析和抗原表位预测分析。结果表明,GS0812-4分离株的N、H、F蛋白基因与其他分离株相应序列的核苷... 通过RT-PCR方法扩增到犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)分离株GS0812-4的N、H、F蛋白基因,然后克隆入pGEM-T Easy载体并进行序列分析和抗原表位预测分析。结果表明,GS0812-4分离株的N、H、F蛋白基因与其他分离株相应序列的核苷酸同源性分别为93.2%~97.8%、90.3%~97.3%、93.2%~97.8%,其推定的氨基酸同源性分别为96.6%~98.7%、91.3%~97.9%和96.6%~98.7%;GS0812-4分离株N、H、F蛋白基因与疫苗株相应序列的核苷酸同源性分别为93.1%~93.8%、89.4%~90.5%、93.1%~93.8%,其推定的氨基酸同源性分别为96.4%~97.3%、89.3%~91.3%、96.4%~97.3%。由基因系统发育树可知,GS0812-4与疫苗株处于不同的分支,其中与MKY-KM08的亲缘关系最近,但GS0812-4在N、H、F 3个基因系统发育树上与其他同一毒株的亲缘关系远近不同。H、F蛋白的抗原表位预测结果表明,GS0812-4与MKY-KM08和疫苗株的抗原表位均有差异。说明GS0812-4是野毒株,与MKY-KM08属于同一基因型,来源于同一毒株,但两毒株间的H蛋白和F蛋白的抗原表位仍有差异。 展开更多
关键词 犬瘟热病毒 H蛋白 H蛋白 F蛋白 变异分析
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犬瘟热病毒N蛋白基因融合蛋白原核表达条件的优化与蛋白纯化 被引量:1
3
作者 简子健 马素贞 +2 位作者 申卫红 翟少华 赵森 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第2期336-340,共5页
【目的】提高犬瘟热病毒N蛋白基因在大肠杆菌中表达可溶性GST融合蛋白的含量。【方法】研究诱导剂(IPTG)的最佳加入时间、诱导剂(IPTG)浓度、诱导时间以及不同温度条件对GST-CDV N融合蛋白表达的影响,获得在大肠杆菌中的最佳的表达条件... 【目的】提高犬瘟热病毒N蛋白基因在大肠杆菌中表达可溶性GST融合蛋白的含量。【方法】研究诱导剂(IPTG)的最佳加入时间、诱导剂(IPTG)浓度、诱导时间以及不同温度条件对GST-CDV N融合蛋白表达的影响,获得在大肠杆菌中的最佳的表达条件,然后再在最佳条件下大量的表达,用GST-Sepharose 4B亲和层析柱对GST-CDV N融合蛋白进行纯化,得到最大量的可溶性融合蛋白,并对蛋白含量进行测定。【结果】大肠杆菌BL21(DE3)转化菌在37℃培养3.5 h(OD600=1.314)时,加入IPTG使终浓度为1 mmol/L,然后在27℃诱导8 h,GST-CDV N融合蛋白可溶性表达量最高,达到0.862 mg/mL。【结论】确定了犬瘟热病毒N蛋白基因的优化表达条件,为犬瘟热病毒分子免疫学诊断和亚单位疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 犬瘟热病毒 n蛋白基因 融合蛋白 原核表达条件的优化 纯化
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新基因MAGE-n表位肽与人HSP70融合基因的构建及表达纯化 被引量:1
4
作者 张秀敏 史琪琪 +6 位作者 李增山 叶菁 王军伟 林慧 曲萍 胡沛臻 隋延仿 《中国医药生物技术》 CSCD 2010年第4期257-260,共4页
目的构建MAGE-n159-167(QLVFGIEVV)表位肽与人热休克蛋白70(HSP70)的融合基因并表达纯化。方法应用PCR方法,将QLVFGIEVV的cDNA序列融合到人HSP70基因的3'端,将融合基因克隆入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a(+)QLVFGI... 目的构建MAGE-n159-167(QLVFGIEVV)表位肽与人热休克蛋白70(HSP70)的融合基因并表达纯化。方法应用PCR方法,将QLVFGIEVV的cDNA序列融合到人HSP70基因的3'端,将融合基因克隆入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a(+)QLVFGIEVV-HSP70;采用双酶切(Sac Ⅰ、Hind Ⅲ)及PCR鉴定后测序;转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),用IPTG诱导表达,Ni Sepharose6FF亲和填料进行分离纯化,SDS-PAGE检测表达及纯化结果。结果经PCR扩增成功获得约2.0kb的目的片段,重组体经Sac Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切分析及PCR结果与预期结果一致,测序正确。转入重组质粒的E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导、SDS-PAGE分析得到71kD左右的目的蛋白条带。用Ni Sepharose6FF亲和填料分离纯化,获得了纯化的融合蛋白。结论成功构建原核表达载体pET-28a(+)QLVFGIEVV-HSP70,并获得纯化的融合蛋白,为基于MAGE-n的肿瘤疫苗研制提供良好的抗原奠定了实验基础。 展开更多
关键词 HSP70热休克蛋白类 基因融合 癌症疫苗 MAGE-n 表位肽 原核表达
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大鼠Shh-N融合蛋白的表达、纯化及功能研究
5
作者 孙朝晖 赖燕来 +3 位作者 曾文文 郭雅南 左焕琮 谢佐平 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2003年第6期969-973,共5页
为了获得重组SonichedgehogN端蛋白 (Shh N)并研究其功能 ,应用PCR技术扩增Shh NcDNA ,然后克隆至原核表达质粒中 ,转化E .coli后获得表达菌株 ,经 1mmol/LIPTG诱导高效表达出带有His tag的融合蛋白 ,其中大部分为可溶性蛋白 ,少量为包... 为了获得重组SonichedgehogN端蛋白 (Shh N)并研究其功能 ,应用PCR技术扩增Shh NcDNA ,然后克隆至原核表达质粒中 ,转化E .coli后获得表达菌株 ,经 1mmol/LIPTG诱导高效表达出带有His tag的融合蛋白 ,其中大部分为可溶性蛋白 ,少量为包涵体 .用His tag特异性结合树脂纯化可溶性融合蛋白 ,经SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为单一区带 ,凝胶自动扫描分析表明 ,Shh N的纯度达 85%以上 .纯化后的Shh N在成纤维生长因子 8(FGF8)的协同作用下 ,能诱导神经前体细胞 (NPC)向酪氨酸羟化酶阳性神经元 (TH+ )发育 .在此基础上可以诱导不同类型的人类干细胞定向分化为多巴胺 (DA)神经元 ,从而为临床治疗帕金森病 (PD) 展开更多
关键词 重组融合蛋白 蛋白质纯化 神经前体细胞 TH免疫阳性神经元
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SARS病毒N蛋白的原核重组载体的构建和表达
6
作者 罗凤玲 章晓联 +2 位作者 冯勇 吴建国 朱应 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2004年第5期40-43,共4页
将SARS病毒N蛋白的基因克隆到原核表达载体 pGEX KG上 ,使其在大肠杆菌DH5α菌株中以与GST蛋白融合的形式表达。采用GluthathionSepharose 4B亲和层析柱对融合蛋白进行纯化 ,并用SDS PAGE和WesternBlot对表达的融合蛋白进行分析鉴定。... 将SARS病毒N蛋白的基因克隆到原核表达载体 pGEX KG上 ,使其在大肠杆菌DH5α菌株中以与GST蛋白融合的形式表达。采用GluthathionSepharose 4B亲和层析柱对融合蛋白进行纯化 ,并用SDS PAGE和WesternBlot对表达的融合蛋白进行分析鉴定。结果表明 ,本实验成功地构建了高效表达SARS病毒N蛋白的重组表达载体 ,所获得的融合蛋白可以直接用于SARS抗体的检测 ,可用于SARS的早期诊断及SARS疫苗的研究。 展开更多
关键词 SARS病毒 n蛋白 原棱表达 GST融合蛋白
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Ⅱ型葡萄糖异构酶N端随机卷曲序列的嫁接效应
7
作者 邓辉 王广林 +1 位作者 陈乃东 陈乃富 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第8期953-961,共9页
木糖/葡萄糖异构酶(xylose/glucose isomerase,XIase/GIase)是果葡糖浆生产的关键用酶,也是重要的模式酶,其组成域的结构和功能一直是研究的热点。本研究采用重叠PCR技术将源自超嗜热菌Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus的Ⅱ型... 木糖/葡萄糖异构酶(xylose/glucose isomerase,XIase/GIase)是果葡糖浆生产的关键用酶,也是重要的模式酶,其组成域的结构和功能一直是研究的热点。本研究采用重叠PCR技术将源自超嗜热菌Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus的Ⅱ型葡萄糖异构酶(TTGIase)N端31个氨基酸序列融合到嗜热菌Thermobifida fusca的I型葡萄糖异构酶(TFGIase)的N端,构建了融合蛋白NTFGIase。发酵实验结果显示,在相同培养和诱导条件下,N-TFGIase菌体单位浓度产酶量比TFGIase高出约40%;酶学检测结果显示,N-TFGIase比酶活较TFGIase高出26%,最适温度较TFGIase高出5℃,75℃下的半衰期较TFGIase延长30%,最适p H较TFGIase降低1.0。序列分析表明,TTGIase N端序列的mRNA二级结构不形成有阻碍的颈环结构,提高了融合蛋白的表达效率;其含有的31个氨基酸残基的疏水性指数均小于0,利于融合蛋白的初始折叠和包装;其含有的酸性氨基酸残基比例约为碱性氨基酸残基比例的两倍,减小了酸性介质环境对融合蛋白分子表面的影响。实验结果提示,将来自超嗜热菌的Ⅱ型XIase/GIase的N端随机卷曲序列融合到I型XIase/GIase N端,能够提高后者的热稳定性、酸稳定性和表达效率等酶学性质,与我们的预测结果相一致,这为酶的分子改造和生产应用提供了参考。 展开更多
关键词 融合蛋白 Ⅱ型木糖/葡萄糖异构酶n端序列 嫁接效应 序列分析
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多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2的原核表达、纯化及酶活检测
8
作者 贾伟 杭赛宇 +2 位作者 史宁 周迎会 吴士良 《江苏大学学报(医学版)》 CAS 2006年第2期93-96,共4页
目的:以人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAc-T2)为研究对象,利用载体pGEX-5X-3在大肠杆菌(E.Coli)BL21中原核表达其编码序列,并对表达产物进行纯化、复性及酶活检测。方法:首先利用PCR技术从克隆载体pDONR201-T2得到ppGalNAc-T... 目的:以人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAc-T2)为研究对象,利用载体pGEX-5X-3在大肠杆菌(E.Coli)BL21中原核表达其编码序列,并对表达产物进行纯化、复性及酶活检测。方法:首先利用PCR技术从克隆载体pDONR201-T2得到ppGalNAc-T2全长编码序列,将其亚克隆至原核表达载体pGEX-5X-3,形成重组表达质粒pGEX-5X-3/T2。重组质粒转化大肠杆菌DH5α,测序鉴定后转化BL21,异丙基硫代半乳糖(IPTG)诱导后,表达产物为主要以包涵体形式存在的融合蛋白。对其复性后用谷胱甘肽-琼脂糖(G lutath ione-Sepharose)4B亲和层析柱进行纯化。然后根据ppGalNAc-T2的催化功能,设计底物,建立酶促反应体系,利用高效液相色谱(HPLC)进行酶活分析。结果:成功构建了原核表达重组载体pGEX-5X-3/T2,通过蛋白质电泳检测到分子量约为90 kD的融合蛋白的表达,利用亲和层析得到纯化的酶蛋白,并经W estern印迹得以验证。反应后体系上柱洗脱后出现酶促反应的产物洗脱峰。结论:成功构建了重组表达载体pGEX-5X-3/T2,ppGalNAc-T2全长编码序列被成功表达、纯化及复性,检测到具有酶活性。 展开更多
关键词 多肽:n-乙酰氨基半乳糖转移酶2 原核表达 GST融合蛋白 谷胱甘肽-琼脂糖米和层析 酶活检测
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一株PRRSV N蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定 被引量:5
9
作者 李敏华 王倩 +1 位作者 田志军 金涛 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期279-283,共5页
为了制备具有阻断能力的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的单克隆抗体(MAb),本研究以PRRSV SD53株感染Marc-145细胞后的上清作为免疫原免疫BALB/c雌鼠,筛选获得一株稳定分泌抗PRRSV MAb的杂交瘤细胞株(1H4)。鉴定结果显示,1H4 MAb是Ig... 为了制备具有阻断能力的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的单克隆抗体(MAb),本研究以PRRSV SD53株感染Marc-145细胞后的上清作为免疫原免疫BALB/c雌鼠,筛选获得一株稳定分泌抗PRRSV MAb的杂交瘤细胞株(1H4)。鉴定结果显示,1H4 MAb是Ig G1亚类,轻链为κ链。1H4细胞上清经间接免疫荧光(IFA)检测其效价是1∶40,腹水的IFA效价是1∶3 200。阻断ELISA试验显示1H4 MAb与病毒的结合能够被PRRSV阳性血清阻断。Western blot试验显示1H4 MAb可以特异性识别PRRSV的N蛋白,经截短表达N蛋白鉴定该MAb的抗原识别序列为N蛋白末端aa 107~aa 123。该抗原表位在美洲型PRRSV中高度保守,该MAb的制备为进一步建立特异性强、灵敏度高的PRRSV阻断ELISA检测方法奠定了基础。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 单克隆抗体 细胞融合 n蛋白 表位鉴定
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氨浓度升高对CHO细胞维持期抗体融合蛋白的表达及N-糖基化的影响 被引量:2
10
作者 陈欣宁 赵亮 +2 位作者 范里 刘旭平 谭文松 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期93-102,共10页
为了深入理解在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞流加培养过程中氨对抗体融合蛋白表达和N-糖基化的作用,认识氨影响N-糖基化加工的作用位点,考察了在细胞维持期(产物表达期)不同氨浓度条件与CHO细胞维持与代谢、抗体融合蛋白表达和N-糖链结构的关... 为了深入理解在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞流加培养过程中氨对抗体融合蛋白表达和N-糖基化的作用,认识氨影响N-糖基化加工的作用位点,考察了在细胞维持期(产物表达期)不同氨浓度条件与CHO细胞维持与代谢、抗体融合蛋白表达和N-糖链结构的关系。结果显示,氨浓度在5-12 mmol/L范围内对维持期的细胞生长曲线、葡萄糖和谷氨酰胺的消耗以及乳酸和氨的生成情况没有明显影响。但当氨浓度大于5 mmol/L时,随着氨浓度的升高,抗体融合蛋白的唾液酸化程度和半乳糖化程度均不断降低,而岩藻糖基化程度和高甘露糖糖型比例则没有变化。当氨浓度升高至大于9 mmol/L后,抗体融合蛋白的表达能力和最终表达量开始降低。因此,应在细胞培养工艺过程开发时控制氨的生成至小于5 mmol/L,以避免氨的累积导致产物的半乳糖化和唾液酸化程度降低以及产物表达量下降。 展开更多
关键词 CHO细胞培养 抗体融合蛋白 n-糖基化 唾液酸
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不同肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白N-糖基化修饰糖链的初步分析 被引量:4
11
作者 何椿鹏 华玲 +8 位作者 杨小盼 万德有 李萌萌 王清清 陈方 董立厚 高新 高月 宋海峰 《国际药学研究杂志》 CAS CSCD 2013年第3期344-349,364,共7页
目的建立基于LC-MS的N-糖基化修饰糖链的分析方法,并比较不同肿瘤坏死因子受体(TNFR)-Fc融合蛋白N-糖基化修饰差异。方法用肽-N-糖苷酶F释放糖蛋白中的修饰糖链,有机溶剂沉淀蛋白后,利用还原胺化反应将2-氨基苯甲酰胺标记至糖链上,并通... 目的建立基于LC-MS的N-糖基化修饰糖链的分析方法,并比较不同肿瘤坏死因子受体(TNFR)-Fc融合蛋白N-糖基化修饰差异。方法用肽-N-糖苷酶F释放糖蛋白中的修饰糖链,有机溶剂沉淀蛋白后,利用还原胺化反应将2-氨基苯甲酰胺标记至糖链上,并通过亲水作用萃取柱除去过量标记试剂,所得糖链采用ZIC-HILIC亲水作用色谱柱结合离子阱质谱进行分析。以市售TNFR-Fc融合蛋白为标准品,优化影响标记效率的各种因素后,对A和B两种TNFR-Fc融合蛋白制品的N-糖基化修饰糖链进行了分析和比较。结果 TNFR-Fc融合蛋白A和B中的修饰糖链主要含有岩藻糖、末端唾液酸、末端半乳糖、末端N-乙酰葡糖胺等糖型,且末端唾液酸含量相近,但融合蛋白A的岩藻糖和末端N-乙酰基葡萄糖的含量显著高于融合蛋白B,而融合蛋白B末端半乳糖含量高于融合蛋白A。结论成功建立了基于LC-MS的N-糖基化修饰糖链的分析方法,该方法可有效分析糖蛋白中的修饰糖链类型和含量比例,对于详细表征糖蛋白药物结构及性质具有参考价值,并为进一步研究糖基化对糖蛋白药物药理活性以及药代动力学研究奠定了良好基础。 展开更多
关键词 肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白 n-糖基化 2-氨基苯甲酰胺标记 LC-MS ZIC-hiLIC 糖型
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NNMT基因重组表达质粒的构建以及在大肠杆菌中的表达 被引量:1
12
作者 马春芳 张钧 +1 位作者 谢鑫友 周美霞 《浙江医学》 CAS 2006年第1期10-12,共3页
目的利用pGEX-4T-2表达系统表达制备尼克酰胺N-甲基转移酶(NNMT)抗原。方法根据NCBI核苷酸数据库编码为gi:12652950人NNMTcDNA序列,设计合成编码NNMT的DNA引物,并分别在5'端和3'端设计BamHI和XhoI位点,利用RT-PCR从人肝组织中克... 目的利用pGEX-4T-2表达系统表达制备尼克酰胺N-甲基转移酶(NNMT)抗原。方法根据NCBI核苷酸数据库编码为gi:12652950人NNMTcDNA序列,设计合成编码NNMT的DNA引物,并分别在5'端和3'端设计BamHI和XhoI位点,利用RT-PCR从人肝组织中克隆NNMT基因,经T-A克隆、亚克隆至pGEX-4T-2表达载体,重组质粒转化到大肠杆菌BL-21-STAR(DE3),经异丙基-β-D-硫代乳糖苷诱导表达,Glu-tathioneSepharose4B亲和层析制备融合蛋白(GST-NNMT)。通过DNA测序来证实质粒pGEX-4T-2DNNMT的正确性,SDS-PAGE电泳以及Western-blot判断GST-NNMT蛋白的准确性。结果限制性内切酶和DNA测序结果表明,编码NNMT蛋白的DNA序列准确插入到pGEX-4T-2多克隆位点,成功构建表达质粒pGEX-4T-2DNNMT。菌液超声破碎后,融合蛋白主要存在于裂解上清液中,表达量约占菌体总蛋白表达量的20%,每升菌液可表达融合蛋白约4.5mg。Western-blot证实制备的蛋白为GST-NNMT。结论成功地利用基因重组技术制备了NNMT,为制备抗NNMT单克隆抗体和ELISA试剂盒打下基础。 展开更多
关键词 尼克酰胺n-甲基转移酶 抗原 融合蛋白表达
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重组pCMV-N-Tudor-SN点突变质粒的构建及表达 被引量:1
13
作者 杨文栋 苏超 +5 位作者 张春燕 赵亚丽 任媛媛 高星杰 杨洁 何津岩 《天津医科大学学报》 2016年第1期5-8,共4页
目的:构建Tudor-SN蛋白的Serine426(S426)、Serine781(S781)、Threonine240(T240)和Threonine429(T429)的点突变质粒,并使该重组质粒能够在He La细胞中融合表达。方法:利用定点突变技术,对Tudor-SN蛋白进行S426A、S781A、T240A、T429A... 目的:构建Tudor-SN蛋白的Serine426(S426)、Serine781(S781)、Threonine240(T240)和Threonine429(T429)的点突变质粒,并使该重组质粒能够在He La细胞中融合表达。方法:利用定点突变技术,对Tudor-SN蛋白进行S426A、S781A、T240A、T429A点突变,通过双酶切的方法获得Tudor-SN.Mutants片段,最后将其连入到p CMV-N-Flag载体中。在He La细胞中转染该质粒,利用Western blot技术检测质粒表达效率。结果:(1)重组质粒经双酶切鉴定,可以观察到载体与Tudor-SN.Mutants的条带。(2)转染突变质粒后可看出He La细胞中有Flag蛋白表达。结论:质粒构建成功,可以用于下一步科学研究使用。 展开更多
关键词 人类Tudor-Sn蛋白 pCMV-n-Flag 重组质粒 融合蛋白
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HIV-1 Gag P17m的融合表达、纯化及NMT有效底物
14
作者 马涵慧 杨力 +1 位作者 杨新颖 李伯良 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第4期458-462,共5页
利用PCR技术扩增编码HIV 1GagP17m的DNA片段 ,进而构建了T7启动子控制下的C端His Tag融合表达质粒pMF P17mHT .SDS PAGE分析结果表明 ,融合蛋白 (约 2 1kD)在大肠杆菌BL2 1(DE3)中得到高表达 ,表达产物约占全菌蛋白 2 0 % .该融合蛋白... 利用PCR技术扩增编码HIV 1GagP17m的DNA片段 ,进而构建了T7启动子控制下的C端His Tag融合表达质粒pMF P17mHT .SDS PAGE分析结果表明 ,融合蛋白 (约 2 1kD)在大肠杆菌BL2 1(DE3)中得到高表达 ,表达产物约占全菌蛋白 2 0 % .该融合蛋白主要以可溶性形式存在 ,通过金属离子 (Ni2 +)螯合亲和层析予以纯化 ,纯度在 90 %以上 .体外标记结果表明 ,融合表达的P17mHT能被人NMT有效地N端豆蔻酰化 .这些结果为深入研究筛选HIV 1GagP17或P55的豆蔻酰化专一性抑制剂 。 展开更多
关键词 HIV-1 GAG HIS-TAG 融合表达 蛋白质n端豆寇酰化 纯化 底物
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Luman-N-端融合蛋白的表达、纯化及小鼠免疫效果评价
15
作者 郭挺伟 靳亚平 +1 位作者 张鸯 翁伟平 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期20-23,共4页
Luman-N-端基因转化菌BL21在IPTG的诱导下,用SDS-PAGE检测表达情况,经电洗脱法纯化,利用纯化的蛋白免疫BALB/C小鼠,通过间接ELISA和淋巴细胞增殖转化试验评价免疫效果。结果显示:细菌经IPTG诱导后在56 kD处,出现了特异性蛋白条带,与预... Luman-N-端基因转化菌BL21在IPTG的诱导下,用SDS-PAGE检测表达情况,经电洗脱法纯化,利用纯化的蛋白免疫BALB/C小鼠,通过间接ELISA和淋巴细胞增殖转化试验评价免疫效果。结果显示:细菌经IPTG诱导后在56 kD处,出现了特异性蛋白条带,与预计融合蛋白大小一致,融合蛋白经电洗脱纯化后免疫小鼠,间接ELISA显示抗体效价达到1∶4000,淋巴细胞增殖试验表明与空白组相比,Luman-N-端融合蛋白质量浓度为10、20、40和60μg/mL时,能显著刺激淋巴细胞的增殖(P<0.05);质量浓度为80、100μg/mL能极显著地刺激淋巴细胞的增殖(P<0.01)。 展开更多
关键词 Luman-n-端融合蛋白 表达 纯化 免疫效果
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Luman-N端融合蛋白单克隆抗体的制备
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作者 兰向莉 李晓 +1 位作者 马延森 靳亚平 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2013年第2期1-6,共6页
【目的】制备小鼠抗Luman-N端融合蛋白单克隆抗体。【方法】将GST-Luman-N端载体转化大肠杆菌BL21,用IPTG进行诱导表达,并进行SDS-PAGE电泳,用电洗脱的方法纯化融合蛋白;以纯化的融合蛋白为抗原免疫BALB/C小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/... 【目的】制备小鼠抗Luman-N端融合蛋白单克隆抗体。【方法】将GST-Luman-N端载体转化大肠杆菌BL21,用IPTG进行诱导表达,并进行SDS-PAGE电泳,用电洗脱的方法纯化融合蛋白;以纯化的融合蛋白为抗原免疫BALB/C小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,利用间接ELISA方法筛选阳性孔,采用有限稀释法进行亚克隆,筛选具有抗体分泌活性的单克隆细胞株;应用Western Blot、间接ELISA等方法进行克隆株稳定性、抗体特性的鉴定。【结果】获得1株能稳定分泌抗Luman-N端融合蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2C8),其腹水ELISA单抗效价为1∶1×107。亚型鉴定和亲和力常数分析表明,2C8产生的单克隆抗体亚型为IgG2b型,其亲和力常数约为1×107。Western Blot分析证明,该株单抗能与原核表达的Luman-N端融合蛋白特异性结合,与GST-LRF-N端融合蛋白没有特异性结合。染色体分析结果表明,2C8细胞株染色体数目为(53±2)对。【结论】获得了抗Luman-N端融合蛋白的抗体,该抗体具有良好的特异性和结合活性,可用于对Luman-N端蛋白的进一步研究。 展开更多
关键词 Lumann端融合蛋白 间接ELISA 单克隆抗体
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大鼠N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅲ融合蛋白的表达和纯化
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作者 张 哲 井原义人 +1 位作者 西河淳 谷口直之 《基础医学与临床》 CSCD 1994年第4期57-60,共4页
γ谷氨酰转肽酶(γ-GT)作为一个肿瘤标志酶在肝癌早期诊断上日益受到重视。酶活性升高是由于合成糖蛋白糖链的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅲ(GnTⅢ)活性升高所致。且其敏感度和特异性远远高于血清和组织中γ-GT活性测定,我... γ谷氨酰转肽酶(γ-GT)作为一个肿瘤标志酶在肝癌早期诊断上日益受到重视。酶活性升高是由于合成糖蛋白糖链的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅲ(GnTⅢ)活性升高所致。且其敏感度和特异性远远高于血清和组织中γ-GT活性测定,我们在从大鼠肾脏纯化制备出GnTⅢ纯酶(纯化153000倍)的基础上,根据氨基酸序列分析结果设计寡核苷酸引物,用聚合酶链反应合成GnTⅢcDNA,连接到含麦芽糖结合蛋白质(MBP)cDNA的载体Ma15上,再转化到大肠杆菌E.ColiLXIblue中进行表达,扩增,经AmyloseResin柱亲合层析,所得Ma15再经FactorXa水解后,再次通过上述亲合层析柱,非结合部分即为所要的目的蛋白质。为制备GnTⅢ单克隆及多克隆抗体提供了充足的抗原来源。 展开更多
关键词 乙酰氨基 葡萄糖转移酶 肝肿瘤
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Ssp dnaB蛋白质内含子介导的精氨酸激酶N末端结构域的表达
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作者 石玉林 王博 +1 位作者 姚蜜蜜 汪劲松 《湖北师范学院学报(自然科学版)》 2011年第4期86-91,共6页
采用聚合酶链式反应(PCR)扩增精氨酸激酶(Arginine kinase,AK)N端基因片段,经双酶切后连接至含有蛋白质内含子Ssp DnaB基因的质粒载体pTWIN1中,将Ssp dnaB和N-domain的融合基因利用双酶切手段重组到含有组氨酸标签(His-tag)的质粒载体pE... 采用聚合酶链式反应(PCR)扩增精氨酸激酶(Arginine kinase,AK)N端基因片段,经双酶切后连接至含有蛋白质内含子Ssp DnaB基因的质粒载体pTWIN1中,将Ssp dnaB和N-domain的融合基因利用双酶切手段重组到含有组氨酸标签(His-tag)的质粒载体pET-28a中,得到含有组氨酸标签的融合蛋白基因,并在大肠杆菌Rosetta中表达,为获得具有天然氨基酸序列的精氨酸激酶N端结构域打下基础。 展开更多
关键词 精氨酸激酶 蛋白质内含子却DnaB n端结构域 融合蛋白 蛋白质剪切 镍亲和层析
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小反刍兽疫病毒双抗原夹心时间分辨荧光免疫测定方法的建立 被引量:10
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作者 孙雨 宋晓晖 +7 位作者 董浩 赵柏林 曲萍 蒋菲 杨天意 张晨 杨林 王传彬 《动物医学进展》 北大核心 2019年第4期1-8,共8页
通过优化大肠埃希菌密码子、优化表达条件等方法,在大肠埃希菌表达系统中成功获得了可溶性的N蛋白与NH融合蛋白。进一步基于纯化的可溶性N蛋白与NH融合蛋白建立了小反刍兽疫病毒双抗原夹心时间分辨荧光免疫测定方法。该方法敏感性高,特... 通过优化大肠埃希菌密码子、优化表达条件等方法,在大肠埃希菌表达系统中成功获得了可溶性的N蛋白与NH融合蛋白。进一步基于纯化的可溶性N蛋白与NH融合蛋白建立了小反刍兽疫病毒双抗原夹心时间分辨荧光免疫测定方法。该方法敏感性高,特异性强,能够特异性的检测羊血清中的小反刍兽疫病毒抗体,与其他相关疫病病原无交叉反应;重复性试验组内与组间变异系数均小于10%。对292份临床血清样品进行检测,与法国IDVET竞争ELISA试剂盒比较,阳性样品符合率为92.47%,阴性样品符合率为97.26%,总的符合率为94.86%。该方法与传统的ELISA方法相比,具有敏感性、特异性相当,操作简单、快速,具有较高的推广应用价值。 展开更多
关键词 小反刍兽疫病毒 n活性蛋白 nH融合蛋白 可溶性表达与纯化 时间分辨荧光免疫测定方法
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Establishment of Double-antigen Sandwich Time-resolved Fluorescence Immunoassay for Detection of Pest des Petits Ruminants Virus
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作者 Binglei CAO Zhongyuan GE +3 位作者 Qi YANG Hang SUN Yu SUN Xiaohui SONG 《Agricultural Biotechnology》 2024年第4期21-27,共7页
[Objectives]This study was conducted to explore rapid and large-scale screening and detection of peste des petits ruminants(PPR),so as to provide important technical means for prevention,control and purification of PP... [Objectives]This study was conducted to explore rapid and large-scale screening and detection of peste des petits ruminants(PPR),so as to provide important technical means for prevention,control and purification of PPR.[Methods]Soluble N protein and NH fusion protein were successfully obtained in an Escherichia coli expression system by optimizing E.coli codon and expression conditions.Furthermore,based on purified soluble N protein and NH fusion protein,a double-antigen sandwich time-resolved fluorescence immunoassay method for detection of peste des petits ruminants virus(PPRV)was established.[Results]The method has high sensitivity and specificity and can specifically detect the antibody against PPRV in sheep serum,and it has no cross reaction with other related diseases.The method was used to detect 292 clinical samples,and compared with French IDVET competition ELISA kit.The coincidence rates of positive samples and negative samples from the two kinds of test kits were 92.47%and 97.26%,respectively,and the overall coincidence rate was 94.86%.The intra-group and inter-group coefficients of variation in the repeatability test were less than 10%.[Conclusions]Compared with the traditional ELISA method,the double-antigen sandwich time-resolved fluorescence immunoassay for detection of PPRV has equivalent sensitivity and specificity,and simple and rapid operation,and thus high application and popularization value. 展开更多
关键词 Peste des petits ruminants n active protein nH fusion protein Soluble expression and purification Time-resolved fluorescence immunoassay
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