Nrf2过表达与敲减Hep1-6稳转细胞株的建立

核因子NF-E2相关因子2(Nrf2)是治疗非酒精性脂肪肝(NAFLD)的一个重要靶点分子。为了从体外研究小分子通过靶向Nrf2改善NAFLD的分子机制,首先PCR克隆鼠源Nrf2基因至p Lenti6/V5-D-TOPO空载体得到重组载体p Lenti6/V5-Nrf2,通过测序、酶切鉴定正确后,扩繁质粒,制备慢病毒并将其感染Hep1-6肝癌细胞,用稻瘟醇胚素筛选、鉴定获得稳定表达Nrf2的细胞株。同时,用Nrf2干扰质粒构建慢病毒感染Hep1-6肝癌细胞,通过嘌呤霉素筛选、鉴定Nrf2敲减的细胞株。Q-PCR检测结果显示,过表达稳转株(p Lenti6/V5-Nrf2)中Nrf2基因的表达量为对照组(p Lenti6/V5-Lac Z)的4倍,敲减稳转株中Nrf2基因的表达量大幅度降低。Western blotting显示过表达稳转株的Nrf2表达量明显高于对照组,敲减稳转株的Nrf2表达量明显低于对照稳转株,此结果与Q-PCR结果一致。所克隆的Nrf2基因和敲减基因在Hep1-6小鼠肝癌细胞中得到了正确转录和翻译,稳转细胞株构建成功。