青霉素酰化酶在甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚物上的固定化

用共价键合法将青霉素酰化酶固定化在珠状多孔的甲基丙烯酸缩水甘油酯 (GM)共聚物上 ,研究了固定化反应时间、温度、pH值和酶液用量对固定化青霉素酰化酶的表观活性、表观偶联效率、活性回收及稳定性的影响 .将GM共聚物载体加入到磷酸缓冲液 ( 0 1mol L ,pH 10 8)与青霉素酰化酶液 (每克干载体用酶液 1ml)的混合溶液中 ,在 3 0℃下反应 72h ,单位质量 (干重 )固定化酶的表观活性为 3 48U g ,表观偶联效率为 66 7% ,活性回收为 3 1 7% .

青霉素酰化酶在介孔分子筛MCM-41上的固定化研究

通过改变酶固定化时的pH值、温度、时间以及酶用量,研究了固定化条件对MCM-41载体上固定化青霉素酰化酶的酶活及其稳定性的影响,明确了酶活及其稳定性随固定化条件的变化规律,初步分析了青霉素酰化酶在介孔分子筛MCM-41上的固定化过程.

叶酸靶向的PGA联合N-苯乙酰化阿霉素的抗肿瘤活性

目的考察叶酸靶向的青霉素酰化酶G(PGA)联合前药N-苯乙酰化阿霉素(DOXP)对叶酸受体阳性肿瘤细胞的活性。方法通过双功能偶联剂EDC将叶酸与PGA偶联,荧光显微镜观察HeLa和SKOV3细胞对叶酸-PGA的摄取,MTT法检测DOXP联合叶酸-PGA对HeLa和SKOV3细胞的毒性。结果叶酸-PGA能被HeLa和SKOV3细胞选择性摄取;DOXP在叶酸-PGA的作用下对HeLa和SKOV3细胞的IC50分别为0.72和0.75μmol.L-1,均低于阿霉素。结论叶酸-PGA的特异性靶向作用提高了阿霉素对HeLa和SKOV3细胞的敏感性。

小菜蛾对抑太保的敏感性及其酰胺酶的活力

不同虫龄小菜蛾对抑太保的敏感性差异较大 ,其中 4龄是 1龄的 1 1 .6倍 .不同温度下抑太保对 3龄幼虫的 LC50 随温度的升高而迅速下降 ,1 0℃时为 1 2 43 .94mg·L- 1 ,3 5℃时则下降到 5 .0 6mg·L- 1 .酰胺酶的米氏常数 (Km)为 3 .65× 1 0 - 5nmol,最大反应速度 (Vm ax)为 0 .1 465 nmol· mg- 1 ·min- 1 .4龄幼虫酰胺酶的比活力和总活力随温度的升高而增大 .4℃饲养 1 5 d、1 0℃饲养 1 0 d及 2 5℃饲养条件下 ,4龄幼虫酰胺酶的比活力差异不大 ;但 3 5℃饲养 2 d与前 3个饲养条件相比 ,4龄幼虫酰胺酶的比活力差异较大 .酰胺酶的比活力和总活力均随虫龄的增长而增大 ,4龄与 1 -3龄相比酰胺酶的比活力差异较大 。

氰基水解酶在有机合成中的应用

腈化物是有机合成中的重要中间体 ,因为其中的氰基可以通过多种方法引入 ,又能进一步转化成其它官能团。用氰基水解酶实现氰基降解不仅反应条件温和 ,少污染、易处理 ,更重要的是能实现一般化学转化所不能实现的优良的化学、区域及立体选择性。不管是从学术角度还是工程角度来看 。

一种新型固定化青霉素酰化酶的性能及动力学常数的测定

测定了一种以自制的新型载体制备的固定化青霉素酰化酶的基本性质和各项动力学参数．固定化酶的稳定性与中科院微生物研究所用同种游离酶制备的纤维状固定化酶相当；其活性对温度和ｐＨ值的变化不如游离酶敏感；米氏常数、底物抑制常数、苯乙酸和６－氨基青霉烷酸的抑制常数分别为：０．６７９，７４９，２．２４和９２ｍｍｏｌ／Ｌ．

甲氧虫酰肼对舞毒蛾幼虫多功能氧化酶和羧基酰胺酶活性的影响

甲氧虫酰肼是昆虫蜕皮激素类似物,能干扰昆虫新表皮的形成。为了研究甲氧虫酰肼对舞毒蛾(Ly-mantria dispar)杀虫活性以及与其代谢相关酶的活性,采用叶片药膜法测定了甲氧虫酰肼对舞毒蛾2、3龄幼虫毒力及对其多功能氧化酶(MFOs)和羧基酰胺酶活性的影响。结果表明:甲氧虫酰肼对舞毒蛾2、3龄幼虫,48 h LC50分别为14.004、24.105 mol.L-1;48 h LC5分别为1.573、2.090 mol.L-1;48 h LC20分别为4.575、6.898 mol.L-1。用甲氧虫酰肼亚致死剂量48 h LC5和48 h LC20处理舞毒蛾幼虫后,2龄幼虫MFOs活性表现出先激活再抑制再激活;3龄幼虫则表现出先抑制再激活再抑制的作用;2～3龄幼虫羧基酰胺酶活性均表现出先激活再抑制再激活再抑制。可见,甲氧虫酰肼作为非甾醇类蜕皮激素竞争物中的新型化合物,对舞毒蛾幼虫有较高的生物活性,对舞毒蛾幼虫体内MFOs和羧基酰胺酶活性具有明显干扰作用。

2016—2018年某医院耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌的耐药性及临床特征分析

目的了解耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌(CRPA)的耐药情况及临床特征,为临床治疗及医院感染防控提供依据。方法选取2016—2018年自贡市第一人民医院分离的临床菌株,采用WHONET 5.6及SPSS 19.0软件对数据进行分析。结果共分离出铜绿假单胞菌936株,其中2016—2018年分别为277、338和321株,CRPA的检出率分别为10.11%、10.65%和8.72%,CRPA的总体检出率为9.83%。科室分布以呼吸内科(31.52%)、重症医学科(13.04%)、泌尿外科(9.78%)、中西结合科(6.52%)和神经外科(6.52%)为主。标本类型中,以痰液为主,占78.26%,其次为尿液,占13.04%。年龄分布以>60~70岁(28.26%)和>50~60岁(23.91%)人群最多见。3年间,CRPA对庆大霉素的耐药率呈逐年增长趋势,差异有统计学意义(P<0.05),而对其他常见抗菌药物的耐药率呈稳定趋势,对氨基糖苷类抗菌药物耐药率较低(<20.0%),亚胺培南比美罗培南具有更高的CRPA检出灵敏度(P<0.05),其检出率分别为90.22%和69.57%。临床治疗以两种或三种抗菌药物联合应用为主(70.65%),50%以上病人接收了糖皮质激素的抗炎治疗。结论我院的CRPA以呼吸道感染为主,多见于呼吸内科和重症医学科,其感染会增加病人经济负担及病人住院时间,临床及感染防控部门应采取措施以减少其流行。

反胶团酶促水解青霉素G制备6-APA

研究将青霉素酰化酶包埋于ＡＯＴ／异辛烷反胶团中水解青霉素Ｇ制备６－ＡＰＡ的工艺，探讨了各种操作条件对水解过程的影响。结果表明，在反胶团酶反应体系中，底物浓度提高了一倍左右，且在反应过程中不需滴碱调节ｐＨ值。在水相与反胶团体系各自的最适条件下分别进行水解反应实验，结果表明，青霉素酰化酶在反胶团体系中的酶活力高于水相酶活力，水解６ｈ 后其转化率可达７０％ 以上；与相应的水相酶促反应相比，转化率提高了３０％ 。

青霉素酰胺酶在AOT/异辛烷反胶团中的稳定性研究

通过将青霉素酰胺酶包埋于ＡＯＴ／异辛烷反胶团中，对其稳定特性进行了研究。结果表明，经反胶团包埋后，青霉素酰胺酶的热稳定性和ｐＨ稳定性较水相酶有所提高；该酶的热失活动力学特性表明，在５０°Ｃ下保温９０ ｍ ｉｎ 后酶活仍保留７５％ 左右。

影响五步蛇毒蛋白C激活剂酰胺酶活性的实验因素

目的:探讨可能影响皖南地区五步蛇毒蛋白C激活物(PCA)酰胺酶活性的实验因素。方法:分别采用发色底物法和APTT法检测皖南地区五步蛇毒PCA在不同实验条件下的酰胺酶活性。结果:当实验温度为37℃时该PCA活性最稳定,而温度升高或降低均会抑制其酰胺酶活性(P<0.05);该PCA在pH值为7.0时活性最稳定,偏酸或偏碱则均会明显抑制其活性(P<0.05);但一定浓度范围内的Na+、K+、枸橼酸钠等对其活性无明显影响(P>0.05)。结论:五步蛇毒PCA是一种效价较高、影响因素较少的蛋白C活化试剂。

聚甲基丙烯酸缩水甘油酯固定化青霉素酰化酶性质的研究

应用反相悬浮技术合成了珠状甲基丙烯酸缩水甘油酯 - N ,N′-亚甲基双 (丙烯酰胺 )共聚物 ,并将巨大芽孢杆菌 ( Bacillus megaterium)青霉素酰化酶共价偶联到甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚物载体上 ,制成固定化青霉素酰化酶 ,其表观活性为 3 71 U/g(干重 ) ,水解青霉素 G钾盐的最适温度为 47°C,最适 p H为 8.5 ,在 p H4.5～ 9.0 ,温度 40°C以下时酶的活性稳定 ,表观米氏常数 Km为 1 .3 3× 1 0 -2 mol/L ,最大反应速度 vmax为 1 .2 7× 1 0 -5mol/min,固定化酶在 4°C冰箱保存 3 5 d,再水解 w=0 .0 2的青霉素 G钾盐溶液 ,重复使用 3 0次 ,保留酶活性 88.1 %。

固定化青霉素酰化酶生产6-APA的流程设计

针对本组研制的一种新型固定化青霉素酰化酶，以动力学方程为基础，分别进行了批式反应和连续反应的计算．对于批式反应，计算了不同浓度底物的水解过程和各种抑制因子对反应过程的影响；对于连续反应，计算了不同级数下的需酶量、转化率和成本消耗。结果表明，三、四级连续反应是可行的，有工业应用的前景。

枯草蛋白酶E的突变体

Ser236位于横贯枯草蛋白酶E的α螺旋末端,远离催化活性中心,Ser236的突变不会对酶的活性产生大的影响。用定点突变的方法对枯草蛋白酶E的基因进行改造引入Ser236Cys,可能会形成分子间二硫键,有利于提高酶的稳定性。Ser236Cys变体酶(BP1)活性是野生型蛋白酶E的15倍,热稳定性提高3倍;进一步在其他位点引入突变的变体酶BU1(A1a15Asp/Gly20His/Ser236Cys)和BW1(Ser24His/Lys27Asp/Ser236Cys)活性都比野生型蛋白酶E低,但BW1的稳定性稍高于野生型蛋白酶E。

枯草蛋白酶E的定点突变及其对酶性质的影响

用定点突变的方法研究S2 2 1C/P2 2 5A ,N118S/S2 2 1C/P2 2 5A ,D6 0N/S2 2 1C/P2 2 5A和Q10 3R/S2 2 1C/P2 2 5A突变对蛋白酶活性 ,酯酶活性与蛋白酶活性之比的影响。结果表明 :S2 2 1C/P2 2 5A突变使蛋白酶活性比枯草蛋白酶E低 730 0 0多倍 ,酯酶活性与蛋白酶活性之比是Subtiligase的 3倍 ;N118S/S2 2 1C/P2 2 5A突变使蛋白酶活性和酯酶活性分别比S2 2 1C/P2 2 5A突变下降 3 6倍和 15倍 ,酯酶与蛋白酶活性之比下降 4倍 ,同时增加变体酶的热稳定性 ;D6 0N/N118S/S2 2 1C/P2 2 5A突变使蛋白酶活性比N118S/S2 2 1C/P2 2 5A突变体下降 15倍 ,但对酯酶活性几乎没有影响 ,酯酶与蛋白酶活性之比增加 14倍 ,分别是S2 2 1C/P2 2 5A突变体和Subtiligase的 3 3倍和 10 3倍 ;但是 ,Q10 3R/N118S/S2 2 1C/P2 2 5A突变使蛋白酶活性比N118S/S2 2 1C/P2 2 5A突变体增加 5倍 ,酯酶活性下降5 5倍 ,酯酶与蛋白酶活性之比下降 10 0 0倍。

酰胺酶在小菜蛾对抑太保抗性中的作用

研究结果表明，小菜蛾（ｄｉａｍｏｎｄｂａｃｋｍｏｔｈ，Ｐｌｕｔｅｌａｘｙｌｏｓｔｅｌａ）体内酰胺酶广泛存在于其中肠、脂肪体、表皮及头部，酶活力为０．１１８～０．３０７μｍｏｌｇ－１ｍｉｎ－１．该酶在体细胞中主要以与胞内膜结合的方式存在，也有少部分酶以溶解的方式存在于细胞液中．当反应系统ｐＨ值为７．５时，酶活力为最高酶活力的８３％；当ｐＨ值为８．５时，酶活力达最大值，然后随着ｐＨ值的升高，酶活力开始缓慢下降．酶反应在１ｈ内，酶活力与时间变化呈直线关系．对抑太保（Ｃｈｌｏｒｆｌｕａｚｕｒｏｎ）抗性的小菜蛾品系（ＢＫＳ、ＴＬＳ、ＡＴＡＢＲＯＮ、ＮＯＭＯＴ、ＨＩＯＫＯ、ＣＡＫＯＳＨＩＭＡ）体内酰胺酶活力明显高于敏感品系（为敏感品系ＯＳＳ的２．４５～２．８１倍）．抗性品系ＴＬＳ酰胺酶活力是敏感品系ＴＬＮ的２．２８倍，抗性品系ＢＫＳ酰胺酶活力是敏感品系ＢＫＮ的２．１８倍．

叶酸偶联的青霉素G酰化酶对叶酸受体阳性肿瘤细胞的靶向作用

目的研究叶酸偶联的青霉素G酰化酶(F-PGA)对叶酸受体阳性肿瘤细胞的靶向作用。方法用激光共聚焦显微镜观察宫颈癌HeLa、卵巢癌SKOV3和肺癌A549细胞对F-PGA以及游离叶酸(F-A)的摄取,并进一步用同位素示踪法加以验证和定量检测。结果F-PGA与F-A相似,均能被叶酸受体阳性的HeLa和SKOV3肿瘤细胞选择性摄取,且有饱和性、可逆性、温度依赖性和高亲和性的特点,但不能被叶酸受体阴性的A549细胞摄取。结论F-PGA与F-A都是通过叶酸受体介导,从而特异性地靶向于叶酸受体阳性肿瘤细胞的。

真养产碱杆菌112R_4的二羧酸单酰胺酰胺水解酶

在一株具有环酰亚胺转化活性的真养产碱杆菌 1 1 2R4 中发现了一种特异性的二羧酸单酰胺酰胺水解酶 (半酰胺酶 ) ,它催化环酰亚胺代谢的第二步反应 ,将二羧酸单酰胺水解为二羧酸和氨。该酶的底物仅限于此代谢途径的第一个酶———酰亚胺酶的产物二羧酸单酰胺 ,而对其它的酰胺类化合物没有明显水解活性。真养产碱杆菌 1 1 2R4 中的半酰胺酶和酰亚胺酶在表达上具有相关性 ,环酰亚胺 (如琥珀酰亚胺 )和二羧酸单酰胺 (如琥珀酰胺酸 )对它们有正调控作用 ,游离氨离子显示出负调控作用 ,琥珀酸则在酶合成和活性两方面均表现出影响作用。对重组大肠杆菌中表达的半酰胺酶粗酶的部分性质进行了研究。钴离子对半酰胺酶的活性表现出促进作用 ,比活力提高到 3.37倍 ,表明半酰胺酶可能是一种金属结合酶。

正交试验法优化酰胺酶PCR条件

以Salinispora arenicola的总DNA作为研究材料,将正交实验法应用于聚合酶链式反应(PCR)上,探求4种主要因素(退火温度、退火时间、DMSO、引物量)在3个水平上的最佳使用量,迅速找到最佳PCR条件,为后续一系列实验铺平道路。实验得出10μL反应体系最佳PCR条件为:DMSO 0.6μL;引物0.6μL;退火温度56℃;退火时间20 s。经验证确定该条件能大大提高目标条带扩增量。

腈的生物转化不对称合成β-氨基酸和β-氨基酰胺

含有腈水合酶和酰胺水解酶的红球菌Rhodococcus erythropolis AJ270能在非常温和的条件下催化一系列β-氨基苯丙腈衍生物的水解反应,生成相应的β-氨基酸和β-氨基酰胺.底物结构对生物转化反应的效率及立体选择性影响很大.3-氨基-3-苯丙腈的生物水解反应显示了较低的立体选择性,而氮甲基取代衍生物的水解反应则显示了中等立体选择性,生成相应S构型β-氨基酸和R构型β-氨基酰胺.氮上大位阻取代基显著降低生物催化效率.