人软骨糖蛋白-39、N端脑钠肽前体在川崎病患儿冠状动脉损伤中的应用价值

目的 探讨人软骨糖蛋白-39(YKL-40)、N端脑钠肽前体(NT-proBNP)在川崎病(KD)患儿冠状动脉损伤(CAL)中的临床应用价值。方法 选取125例KD患儿作为研究对象(KD组),并根据是否合并冠状动脉病变分为CAL组(n=53)及无冠状动脉损伤(NCAL)组(n=72)。选取同期体检的健康儿童(HC组)和同期住院的仅消化道感染的发热患儿(FC组)作为对照。检测血浆YKL-40、NT-proBNP水平。绘制受试者工作特征(ROC)曲线评估YKL-40、NT-proBNP对KD患儿不同时期CAL的诊断价值。结果 KD患儿不同时期(急性期、亚急性期和恢复期)的血浆YKL-40、NT-proBNP水平高于HC组、FC组,差异有统计学意义(P<0.05);CAL组YKL-40水平高于NCAL组,急性期NT-proBNP高于NCAL组,差异有统计学意义(P<0.05)。YKL-40、NT-proBNP及两者联合诊断KD急性期CAL的曲线下面积(AUC)分别为0.813、0.832、0.886;YKL-40、NT-proBNP及两者联合诊断KD亚急性期CAL的AUC分别为0.699、0.522、0.701;YKL-40、NT-proBNP及两者联合诊断KD恢复期CAL的AUC分别为0.982、0.435、0.986。结论 血浆YKL-40和NT-proBNP水平可作为KD早期辅助诊断指标。血浆YKL-40可联合其他指标用于监测KD疾病活动及CAL并发症的发展。

小整联蛋白结合配体N端联结糖蛋白家族在硬组织发育中的调控作用

硬组织发育是生物机体发育过程中的重要组成部分,小整联蛋白结合配体N端联结糖蛋白家族在硬组织发育过程中发挥重要的调控作用,如:促进干细胞的成牙本质分化或成骨分化,调控成牙本质细胞或成骨细胞的基因表达等。编码小整联蛋白结合配体N端联结糖蛋白家族的基因发生突变可引起硬组织矿化异常,导致如低血磷性佝偻病、牙本质发育不全等多种疾病。近年来,学者们对该蛋白家族在硬组织发育中的调控作用开展了深入研究,揭示了该蛋白家族的主要分子调控机制,加深了对其作用及机制的认知。因此,本文对小整联蛋白结合配体N端联结糖蛋白家族在生物硬组织发育中的调控作用及其机制的研究进展进行总结和综述。

O⁃连接⁃N⁃乙酰葡糖胺糖基化蛋白质的富集方法

O-连接-N-乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)糖基化修饰是将N-乙酰葡萄糖胺添加到细胞核和细胞质蛋白质的丝氨酸和苏氨酸残基上的一种丰富的、独特的翻译后修饰,与癌症、神经退行性病变和糖尿病等疾病密切相关。明确O-GlcNAc修饰位点是探究其在相关疾病中调控机制的前提,同时也是临床诊断和靶向干预的关键。本文介绍了近年来O-GlcNAc糖基化修饰与疾病之间的关系以及相关修饰位点的富集方法,包括抗体和凝集素、化学酶法、亲水作用液相色谱法和非天然糖代谢标记等;此外,“凹凸理论”、“定点活化”等靶向标记特定组织内蛋白质的糖基化修饰策略已成为当前研究热点,同时基于“一石多鸟”的多功能酶法标记,以及“一锅法”分析多种糖链结构等方法也将极大促进糖蛋白组学的快速发展。总之,开发更加高效、特异的糖蛋白富集策略,将对阐明包括O-GlcNAc在内的异常糖基化修饰在相关疾病中的调控机制具有重要的研究意义。

3例N-甲基-D-天冬氨酸受体和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白双抗体阳性脑炎分析

目的观察3例罕见的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)抗体相关疾病和抗N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)脑炎重叠综合征(MNOS)患者的临床表现,旨在拓宽对此类综合征临床谱的认识。方法回顾性分析MOG抗体和NMDAR抗体双阳性的3例MNOS患者的资料,收集患者临床特征、神经影像学特征及转归,采用基于细胞转染的间接免疫荧光法(CBA)进行诊断。结果1例同时出现MOG抗体和NMDAR抗体阳性,但临床表现为典型的抗NMDAR脑炎症状;1例为继抗NMDAR脑炎后复发出现脱髓鞘疾病的临床和头颅磁共振成像(MRI)特征,复发时表现为肢体麻木无力、视物模糊、复视等MNOS非典型症状;1例同时出现MOG抗体和NMDAR抗体阳性,但临床表现为典型的抗NMDAR脑炎症状。在MNOS中,MOG抗体相关疾病和抗NMDAR脑炎可同时出现,也可先后出现,癫痫为其最常见的症状;头颅MRI显示患者均存在且主要为幕上病灶,也可累及脑干,未见脊髓病灶,脑脊液均轻度异常。患者发病急性期对一线免疫治疗反应良好,预后较好,但多数患者易复发。结论MNOS患者中抗NMDAR脑炎可同时或相继出现脱髓鞘疾病的临床和/或MRI特征,患者临床表现复杂且多样。对于存在不典型的症状的患者,要求提高对MNOS的认识,并及时治疗。

基于质谱的N-糖蛋白分析进展

N-连接糖基化是蛋白质上常见的翻译后修饰,在修饰位点上具有跟其他小分子修饰(如甲基化、乙酰化、磷酸化)同样的宏观不均一性,也就是蛋白质氨基酸序列上具有多个潜在的修饰位点。但相对于小分子修饰单一的结构,N-糖基化修饰具有来自不同单糖组成,序列结构、链接结构、异头异构,立体构象等多个结构维度的数以万计的结构。这使得N-糖基化在修饰位点上具有额外的微观不均一性,也就是说同一个N-糖基化位点可以以一定的化学计量比修饰不同的糖链。N-糖基化修饰以位点和结构特异的方式调控N-糖蛋白的结构和功能,疾病条件下差异表达的N-糖基化需通过位点和结构特异的定量分析来表征。本文主要介绍最新发展水平的基于质谱的位点和结构特异定量N-糖蛋白质组学及在生物医学中的应用。

利用亲水富集策略分析人血浆中N-糖基化蛋白及N-糖类型

蛋白质的N-糖基化是最重要的翻译后修饰之一,许多已知的血浆肿瘤诊断标志物及治疗靶标都是N-糖基化蛋白。针对血浆的糖蛋白质组研究有利于发现新的蛋白标志物。然而,血浆蛋白质浓度分布的动态范围非常宽,且同一位点上的糖链存在微观不均一性,影响了血浆中糖蛋白的鉴定效率。本文利用亲水材料ZIC-HILIC制备亲水富集柱分别对人血浆中的N-糖链和N-糖肽进行富集,并结合碱性反相色谱进行肽段的预分离和高准确度质谱分析,最终在健康人的血浆中鉴定到了299个糖基化蛋白、637个糖基化位点,并识别出31种不同的糖型。在这些鉴定到的糖基化位点中,新发现有107个N-糖基化位点(占总位点数的16.8%)。本方法操作简单,可以有效富集N-糖肽和N-糖,为在血浆中寻找糖蛋白和糖链生物标志物提供了可靠的手段。

云南4株狂犬病毒N和G基因的克隆及测序

目的：认识云南狂犬病毒株N基因和G基因的结构特征及其与已知毒株的遗传相关性。方法：对2006-2007年云南曲靖（YNQJ07）、昭通（YNZT07）、楚雄（YNMD06）、保山（YNTC06）狂犬病毒株N基因和G基因进行RT-PCR扩增，克隆至pPICZαA载体进行测序，并与已知代表性毒株进行比对及系统发育分析。结果：云南狂犬病毒株均属于基因Ⅰ型毒株，YNQJ07、YNZT07、YNMD06以及近年部分广西、浙江、江苏、湖北、安徽、江西省毒株N基因和G基因核酸序列同源性分别介于97.0%-99.3%、97.4%-99.3%，与其它基因I型毒株同源性分别介于86.3%-90.2%、82.9%-93.0%。YNTC06与泰国和部分广西毒株同源性介于95.0%-95.8%，与其它基因Ⅰ型毒株同源性介于82.9%-92.9%。结论：YNQJ07、YNZT07、YNMD06属于亚组群Ⅱ毒株，YNTC06毒株属于亚组群Ⅲ毒株，云南狂犬病毒核蛋白和糖蛋白存在特异性氨基酸变异位点。

新型核壳型亲水聚合物-硅胶杂化填料的合成及其在蛋白质N-糖链富集中的应用

蛋白质的N-糖基化修饰与多种重要的生理、病理进程密切相关,是多种重大疾病诊断标志物研究的热点。由于糖蛋白本身多是低丰度表达的蛋白质,且糖链结构具有高度微不均一性,这使得蛋白质糖基化修饰的分析具有一定的挑战。本研究利用表面引发-原子转移自由基聚合(SI-ATRP)法,以带有双键的氨基葡萄糖为单体(GMAG),成功制备了新型核壳型亲水聚合物-硅胶杂化填料(pGMAG-SiO2)。由于在硅胶表面引入致密的亲水聚合物层,该填料不仅保持了硅胶良好的机械强度,而且显著提高了其亲水性,因此非常适合作为亲水填料用于蛋白质的N-糖链富集。以麦芽七糖和鸡卵清蛋白的N-糖链为研究对象,考察了该填料对N-糖链的富集效果,并将该杂化填料成功用于人血浆中糖蛋白N-糖链的富集检测,共鉴定了47种糖型。以上结果表明,pGMAG-SiO2填料对N-糖链具有较高的亲和性,可以用于N-糖链的高覆盖率鉴定。

毕赤酵母N-糖基化改造的研究进展

毕赤酵母表达系统具有诸多优点,广泛用于生产重组蛋白。由于其糖基化途径与人不同,表达的糖蛋白为高甘露糖型,改变了糖蛋白的结构,影响其特性和功能,且具有免疫原性,限制了以毕赤酵母为表达系统大量生产重组蛋白的应用。在过去的20多年里,很多研究集中在毕赤酵母N-糖基化人源化改造研究上,希望产生类人的糖链结构,但进展缓慢。近期,毕赤酵母N-糖基化改造研究已经取得了重大进展,产生了类人的末端为唾液酸的糖链结构,为应用毕赤酵母表达系统大量生产重组蛋白铺平了道路。现对毕赤酵母N-糖基化的研究进展进行简述。

凝集素芯片检测肿瘤标志物糖蛋白N-聚糖及其在诊断中的意义

背景与目的:肿瘤的发生、发展伴随着相关糖蛋白的糖基化改变,糖蛋白聚糖结构的多样性对其生理功能起着重要的作用。凝集素芯片是一种简单、快速、高通量的方法,可以分析肿瘤标志物糖蛋白的N-聚糖部分,是肿瘤相关糖蛋白质组学有力的研究工具。本研究探讨使用凝集素芯片检测肿瘤标志物糖蛋白N-聚糖,以期鉴别疾病性质。方法:利用生物芯片技术使用凝胶基片构建以不同凝集素和荧光标记糖蛋白特异性亲和为原理的凝集素芯片,可以检测糖蛋白的N-聚糖的特征性结构,比较相似糖蛋白的差异,进一步可以检测和比较不同来源相同肿瘤标志物糖蛋白的N-聚糖部分的细微差异。结果:凝集素芯片结果准确,荧光标记糖蛋白浓度与荧光值达10～1000nmol/L的Cy3浓度范围内存在线性关系,1mg/ml是合适的凝集素点样浓度;凝集素芯片非常敏感,在本研究的条件下,最低可测得达1pg的相应糖蛋白,凝集素芯片结合荧光探针技术可以鉴别不同来源甲胎蛋白N-聚糖结构的细微差别。结论:凝集素芯片检测糖蛋白N-聚糖结构切实可行、准确方便;凝集素芯片可以给出肿瘤标志物糖蛋白N-聚糖结构的信号模式图及其变化,在疾病的早期诊断方面具有重要意义。

二维电泳和质谱技术鉴定肝细胞癌相关N-连接糖蛋白

目的鉴定与肝细胞癌(HCC)发生发展相关的差异表达N-连接糖蛋白。方法采用刀豆凝集素A(Con A)、晶状体凝集素(LCH)、雪花凝集素(GNA)等3种植物凝集素组成的亲和层析柱,分别从肝永生化细胞系L02和HCC细胞系Huh7、PLC5、SNU449中纯化N-连接糖蛋白、二维电泳分析差异表达的蛋白质斑点,质谱、生物信息学等技术鉴定差异表达蛋白,Western blotting验证了转录调控肿瘤蛋白(TCTP)、上皮细胞黏附分子(Ep CAM)和膜联蛋白A2(annexin A2)在肝永生化及HCC细胞和HCC及癌旁组织中的表达规律,体外侵袭实验检测TCTP沉默后对SNU449的侵袭力影响。结果质谱、生物信息学等技术共鉴定出42个差异表达的蛋白质分子/异质体(HCC细胞中高、低表达的蛋白/异质体分别为14个、28个),代表32个蛋白质分子,其中的22个蛋白含有至少1个N糖基化位点(Net NGlyc 1.0预测)。这些差异表达的蛋白主要参与氧化还原内稳态维系、碳水化合物/能量代谢、糖酵解、抗凋亡等生物学过程。Western blotting检测表明,TCTP、Ep CAM和annexin A2在6个肝癌细胞系PLC5、Hep G2、SNU449、Huh7、HCC7721和SNU473及肝癌组织中表达显著升高,siRNA介导的TCTP沉默明显抑制了HCC细胞系SNU449的体外侵袭能力。结论 TCTP、Ep CAM和annexin可能参与了HCC发生发展过程,TCTP可能成为HCC靶向治疗的分子靶点之一。

慢性胃炎脾虚证患者唾液糖蛋白N-聚糖结构特点

[目的]分析慢性胃炎脾虚证患者酸刺激后总唾液糖蛋白及唾液淀粉酶N-聚糖结构特点．探讨其与淀粉酶活性及脾功能低下的关系。[方法]采用碘分光光度法，分析47例慢性胃炎脾虚证患者、15例慢性胃炎脾胃湿热证患者及12例健康志愿者酸刺激前后唾液淀粉酶活性；通过ConA亲和层析．分离27例慢性胃炎脾虚证患者、14例慢性胃炎脾胃湿热证患者及5例健康志愿者酸刺激后总唾液糖蛋白，分析总糖蛋白及唾液淀粉酶N-聚糖结构特点；通过ConA亲和-反相二维层析，分离13例慢性胃炎脾虚证患者、6例慢性胃炎脾胃湿热证患者及5例健康志愿者酸刺激后总唾液糖蛋白，分析带有不同N-聚糖的总唾液糖蛋白的组成和分布。[结果]酸刺激后，脾虚证组患者的唾液淀粉酶活性呈显著性下降（与酸刺激前比较，P〈0．05），其唾液淀粉酶活性下降率为70％，高于脾胃湿热证组的47％和正常组的8％。此外．脾虚证组患者酸刺激后总唾液糖蛋白及唾液淀粉酶中的ConA强结合组分总峰面积所占比例显著增加，ConA未结合及弱结合组分显著减少，与脾胃湿热证组及正常组比差异有显著性（P〈0．05或P〈0．01）；并发现总唾液糖蛋白中，减少的COrA未结合组分有10．20种不等，减少的ConA弱结合组分有8—17种不等，增加的ConA强结合组分有10。19种不等，其组成和分布显著不同于脾胃湿热证组和正常组。[结论]慢性胃炎脾虚证患者总唾液糖蛋白及唾液淀粉酶N-聚糖结构发生了显著变化，主要表现为ConA强结合组分所占比例显著增加，而ConA未结合及ConA弱结合组分所占比例显著减少，其特征亦以高甘露糖型和杂合型糖链为主，2、3、4天线复杂型糖链为次；而不同糖链类型的糖蛋白组成和分布亦与脾胃湿热证组和正常组显著不同，表明脾虚证患者总唾液糖蛋白及唾液淀粉酶N-糖基化均不完全，这可能与脾虚证患者酸刺激后唾液淀粉酶活性低下及脾功能低下有关。

微量生物样品中糖蛋白N-糖链电喷雾电离质谱分析前处理方法的建立

基于电喷雾电离质谱检测技术,建立了一种可靠、高效、简单,适合于微量糖蛋白N-糖链解离、富集纯化的方法。以糖蛋白牛胰核糖核酸酶(Rib B)和卵清白蛋白(OVA)为模型蛋白直接酶解,比较了4种方法纯化酶解样品的效果。比较了直接酶解和经过聚偏氟乙烯(PVDF)膜富集后酶解微量复杂生物来源样品胎牛血清的酶解效果,最终建立了微量生物样品中糖蛋白N-糖链的质谱分析前处理方法。采用PVDF膜吸附复杂生物样品中的糖蛋白,N-糖苷酶F(PNGase F)酶直接在膜上完成糖链释放(37℃,24 h),采用微晶纤维素柱结合石墨碳柱对糖链进行富集纯化,用于微克级胎牛血清和健康人血清中N-糖链质谱分析的前处理。本方法通用性好,在微量生物样品糖链质谱分析检测的前处理方面具有一定应用价值。

一种新的蛇毒凝血酶原激活物的分离纯化及特征

为获得矛头蝮蛇(Bothrops atrox)蛇毒凝血酶原激活物并研究其基本性质,采用SP SepharoseFast Flow,DEAE-Sepharose Fast Flow和SP Sepharose High Performance等层析方法从巴西矛头蝮蛇蛇毒中分离纯化得到1种单一组分的凝血酶原激活物(prothrombin activator,FⅡA).还原性SDS-PAGE结果显示,其分子质量约为72 kD,等电点为6.67.HPSEC显示纯度大于95%.该酶是1种N连接的糖蛋白,N末端氨基酸序列为ALVLIAFAQYLQQCP,获得登录号为:B3A0N1.其活性可被EDTA-Na2抑制,PMSF对其活性无影响,对凝血酶原的激活过程无需Ca2+、FⅤa、磷脂的参与,为P-Ⅰ金属蛋白酶,对凝血酶原的激活方式与FⅩa相似.本研究纯化与鉴定的新凝血酶原激活物为其药学研究及临床应用提供参考.

秦巴山区人巨细胞病毒gN基因型分布及其与宫内感染的关系

目的探讨陕西秦巴山区母婴人巨细胞病毒(HCMV)感染流行株的包膜糖蛋白gN基因型分布及其与HCMV宫内感染结局的相关性。方法采用ELISA法检测434例孕期妇女血清中HCMV-Ig M及HCMV-IgG,判断秦巴山区孕期妇女HCMV感染情况;采用PCR方法检测孕妇血清和新生儿尿液中的HCMV gN基因,利用限制性核酸内切酶SacⅠ、SalⅠ和ScaⅠ分别对HCMVgN基因进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析。结果①434例孕妇血清中HCMV-Ig M阳性35例,阳性率8.06%;HCMVgN DNA阳性25例,阳性率为5.76%。新生儿尿液中HCMVgN DNA阳性17例,阳性率为3.92%。在35例HCMV-Ig M阳性孕妇中,其配对新生儿尿液HCMV gN DNA阳性11例,HCMV宫内传播率为31.43%。②42例HCMV gN DNA阳性标本(25例孕妇及17例新生儿)gN3型2例、gN4型40例,8例症状性HCMV感染婴儿与8例无症状性感染婴儿及其母亲均具有相同的基因型gN4型;1例病理性黄疸患儿与其母亲基因型为gN3。③新生儿感染症状及预后与基因型之间无相关性。结论陕西秦巴山区母婴HCMV流行株以gN4型为主。gN3、gN4基因型可引起母婴传播。

基于中国HIV-1 CRF01_AE重组亚型gp41 NHR结构域亚单位疫苗的研究

目的:构建基于中国HIV-1 CRF01_AE重组亚型包膜糖蛋白gp41 NHR结构域N51的亚单位疫苗,并进行免疫原性研究。方法:设计4条引物,运用重叠延伸PCR方法扩增出N51Fd基因,将其插入真核表达载体pFUSE-hIgG1-Fc2,构建重组质粒pFUSE/N51Fd并进行序列测定。Western blot法检测N51FdFc-AE重组蛋白的表达。用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠后,ELISA法检测小鼠的抗体反应。结果:成功构建了pFUSE/N51Fd重组质粒,N51FdFc-AE重组蛋白在真核体系获得了高效表达,Western blot结果显示在相对分子质量(Mr)35 000处有目的蛋白条带。小鼠抗血清能特异性识别源于gp41 NHR的抗原,效价高达1∶102 400,平均效价为1∶51 200。结论:改造后的亚单位疫苗能有效激活机体的免疫响应,可用于HIV候选疫苗的研发。

基于超滤膜辅助的糖蛋白全N-连接糖链的富集和质谱解析(英文)

糖基化作为一种常见的蛋白质翻译后修饰,对蛋白质的空间结构、生物功能等具有重要的影响.解析糖蛋白糖链结构有助于更清楚地认识糖蛋白及其功能.本研究建立了一种基于超滤膜富集血清中糖蛋白全N-连接糖链,并利用质谱技术对糖链结构进行分析的方法.根据糖蛋白及其糖链结构之间的分子质量差异,利用Millipore公司的10 ku超滤膜富集血清糖蛋白上酶解(PNGase F)释放的全N-连接糖链,并使用MALDI-TOF/TOF-MS解析糖链结构.通过该技术可以从血清中富集并鉴定到23种独特的N-连接的糖链结构,并且利用二级质谱进行了结构确认.该方法可以被用于从大量生物样本中富集糖蛋白全N-连接糖链,可以达到快速、高通量地解析糖蛋白N-连接糖链的目的.

蛋白质药物糖基化工程化改造研究进展

多种哺乳和非哺乳动物的蛋白质表达系统已成功用于重组糖蛋白药物的生产。糖基化对于生物药品的研究开发至关重要,对生物药品的药效、半衰期及抗原性等产生重要影响。糖基化工程的目的是生产组分明晰、结构均一的N-和O-连接的糖基化蛋白药物。N-糖基化改造的相关研究显示,利用哺乳动物和非哺乳动物表达系统可以表达均匀的N-聚糖重组糖蛋白。与N-糖基化改造相比, O-糖基化的改造研究尚处于起步阶段。首个糖基化工程单克隆抗体已在美国和日本获得上市批准。综述了重组蛋白表达系统的糖基化工程化改造的研究进展,包括蛋白质药物的N-糖基化改造和O-糖基化改造的最新进展,以期为蛋白质药物的糖基化工程改造研究提供参考。

缺失gE基因的牛Ⅰ型疱疹病毒构建及其体外增殖特性比较

为构建gE基因缺失的牛Ⅰ型疱疹病毒(BHV1),本研究在BHV1全基因组感染性细菌人工染色体克隆pBHV1-ZJ的基础上,利用Red E/T重组技术,分别构建了gE基因缺失、gE和gN双基因缺失的pBHV1突变体,通过转染获得了重组病毒rBHV1-△gE,而双基因缺失突变体pBHV1-△gN-△gE则未能观察到细胞病变。病毒噬斑大小和生长曲线试验表明,在感染细胞内和培养基中,rBHV1-△gE滴度与亲本毒株BHV1无明显差异,而rBHV1-△gN显著降低;重组病毒rBHV1-△gE和前期构建的rBHV1-△gN形成的噬斑均显著小于亲本病毒,其大小分别为亲本病毒的18%和64%。rBHV1-△gE和rBHV1-△gN的构建将有助于阐明gE与gN协同作用机制和为研制BHV1新型基因标记疫苗奠定基础。

N糖基化抑制对脑胶质瘤细胞株SWO-38 N-GSLs合成的影响

目的 探讨N糖基化抑制对肿瘤细胞中性鞘糖脂 (N GSLs)合成的影响。方法 以衣霉素 (Tunicamycin)为N 糖基化抑制剂 ,观察其对胶质瘤细胞株SWO 38糖蛋白及N GSLs合成的影响。结果 当衣霉素浓度≥ 5ug ml,作用时间≥ 8小时 ,它可以在体外选择性地抑制N糖蛋白的合成 ,同时也抑制N GSLs的合成 ,而对N GSLs单一组分的相对百分含量无明显影响。结论 N 糖基化抑制剂在抑制细胞N糖蛋白合成的同时 ,对细胞N GSLs的合成也有抑制作用。