基于PINK1-Parkin线粒体自噬通路探讨海昆肾喜含药血清对N2a/APP695细胞的神经保护作用

目的研究海昆肾喜(haikun shenxi,HKSX)含药血清对N2a/APP695细胞的神经保护作用及机制。方法制备HKSX含药血清,高效薄层色谱(high performance thin layer chromatography,HPTLC)对其成分进行分析。应用含药血清干预N2a/APP695细胞,MTT检测HKSX含药血清的细胞毒性;ELISA检测Aβ_(1-42)含量;JC-1法检测线粒体膜电位、DCFH-DA法检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)、ATP检测试剂盒检测三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)评价线粒体功能;免疫印迹法(Western blot)检测PTEN诱导的激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)、Parkin、p62、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated-proteinlight chain-3,LC3)及p-Tau S396蛋白的表达;设置线粒体自噬抑制剂Mdivi-1干预组,Western blot检测PINK1、Parkin、p-Tau S396蛋白表达,ELISA检测Aβ_(1-42)含量,验证HKSX的神经保护作用是否与线粒体自噬密切相关。结果与模型对照组(MC)相比,HKSX低、中、高剂量组Aβ_(1-42)含量明显降低,高剂量组尤为明显(P<0.01);线粒体膜电位及ROS含量明显降低(P<0.01)、ATP含量升高(P<0.01);PINK1、Parkin(P<0.01)及LC3Ⅱ(P<0.01)的表达增加,而p62的表达降低(P<0.01),p-Tau S396蛋白亦降低(P<0.01);而Mdivi-1的干预,在很大程度上抑制了HKSX对PINK1、Parkin蛋白的活化(P<0.01)及对p-Tau S396和Aβ_(1-42)的清除(P<0.01),表明HKSX的神经保护作用依赖于PINK1-Parkin信号通路。结论HKSX能够提高线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin蛋白的表达,激活线粒体自噬,提高线粒体功能,抑制Aβ及p-Tau S396蛋白在神经细胞中的沉积,发挥神经保护作用,从而起到防治AD的效果。

两种培养小鼠神经母细胞瘤N2a细胞方法的比较

目的观察2种不同的培养方法对小鼠神经母细胞瘤细胞(N2a细胞)形态和功能的影响。方法取冻存的细胞经复苏后,分别用DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)/Opti-MEM(1∶1)+5%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)与DMEM+10%FBS培养液进行培养,传至第7代时比较两组在细胞增殖率、细胞分化、粘附、迁移、自发凋亡方面的差异。结果 2种培养液均能用于培养小鼠神经母细胞瘤N2a细胞,DMEM+10%FBS组的细胞分化比例及粘附能力与DMEM/Opti-MEM(1∶1)+5%FBS组相比明显增高,细胞增殖率、迁移能力与细胞凋亡未见明显差异。结论 DMEM/Opti-MEM(1∶1)+5%FBS培养液可使小鼠神经母细胞瘤N2a细胞保持较低水平的分化率,因而更适合运用于诱导N2a分化的实验中。

IGF-1激活20S蛋白酶体β5亚单位活性对N2a细胞活力的影响

目的:探索胰岛素样生长因子(IGF-1)对蛋白酶体的作用,并观察其对小鼠神经母细胞瘤来源的N2a细胞活力的影响,寻找维持细胞活力的有效手段。方法:体外培养N2a细胞加入不同浓度的IGF-1后,分析N2a细胞肽基谷氨酰肽水解酶样(PGPH-L)、胰蛋白酶样(T-L)和糜蛋白酶样(CT-L)三种蛋白酶体活性的变化,real time RT-PCR比较分别具有PGPH-L活性、T-L活性和CT-L活性的20S蛋白酶体β1亚单位(PSMBI)、20S蛋白酶体β2亚单位(PSMB2)、205蛋白酶体β5亚单位(PSMB5)mRNA水平的变化。双荧光素酶实验检测IGF-1对PSMB5转录活性的影响。CCK8实验和Hoechst 3342/PI染色实验检测IGF-1和PSMB5对N2a细胞活性和凋亡的影响。结果:应用不同浓度的ICF-I干预N2a细胞后,PGPH-L活性和CT-L活性均显著增高,其中CT-L活性升高最显著,50 ng/ml和100 ng/ml ICF-1干预后,CT-L活性分别是对照组的1.32倍(P<0.05)和1.49倍(P<0.01),但是IGF-1干预后T-L活性无显著变化;real time RT-PCR结果显示应用100 ng/ml ICF-1作用后,PSMB5和PSMBI的mRNA表达水平显著上升(P<0.05);双荧光素酶结果显示IGF-1能够上调N2a细胞PSMB5转录活性;CCK8实验和Hoechst 3342/PI染色结果表明IGF-1干预使N2a细胞活力增强(P<0.01),调亡细胞减少;相反,敲低PSMBS后,N2a细胞活力减弱(P<0.05),调亡细胞增多;使用IGF-I干预PSMB5-siRNA组,发现PSMB5-iRNA组细胞活力较NC-siRNA组降低(P<0.05)、凋亡细胞增加。结论:ICF-1通过激活CT-L蛋白酶体活性,提高N2a细胞的活力。

miR-124-3p通过负调控Caveolin-1表达N2a/APPswe细胞凋亡率及细胞内钙离子浓度

目的:探讨在阿尔茨海默病(Alzheimer’s diseases,AD)细胞模型中miR-124-3p通过调控Caveolin-1的表达对细胞凋亡率及钙离子浓度的影响。方法:体外培养野生型N2a(N2a/WT)和N2a/APPswe细胞,real-time PCR及Western blot分别检测miR-124-3p与β-淀粉样蛋白前体蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)m RNA及蛋白的表达。双荧光素酶报告实验分析miR-124-3p与Caveolin-1之间靶向调控关系。N2a/APPswe细胞瞬时转染miR-124-3p模拟物(mimics),real-time PCR、Western blot分别检测Caveolin-1 m RNA和蛋白的表达。N2a/APPswe细胞分别瞬时转染miR-124-3p模拟物(mimics)、pc DNA-Caveolin-1、Caveolin-1-si RNA,流式细胞仪分析细胞凋亡水平,测定细胞内游离钙离子浓度。结果:与WT组相比,APPswe组APP m RNA和蛋白水平表达都明显升高(分别为P=0.000,P=0.000),miR-124-3p表达明显降低(P=0.000)。双荧光素酶报告实验表明,和与突变型载体(p GL3-Caveolin-1 3’UTR MUT)共转染组相比,与野生型载体(p GL3-Caveolin-1 3’UTR WT)共转染组的相对荧光素酶活性和明显减弱(P=0.004);转染miR-124-3p mimics后,与空载体组比较,miR-124-3p mimcs转染组的Caveolin-1 m RNA和蛋白的表达明显下调(分别为P=0.000,P=0.000);分别转染miR-124-3p mimics、Caveolin-1-si RNA后,与空载体组比较,细胞凋亡率降低(分别为P=0.000,P=0.000),游离钙离子浓度降低(分别为P=0.000,P=0.000);转染pc DNA-Caveolin-1后,得到与上述相反的结果(分别为P=0.000,P=0.000)。结论:miR-124-3p可以通过靶向下调Caveolin-1的表达,抑制AD细胞凋亡,降低细胞中游离钙离子浓度,从而发挥神经保护作用,为AD的防治提供新的思路和靶点。

miRNA-181b在氧-糖剥夺致N2A细胞缺血损伤中的作用及对热休克蛋白A5表达的调节

目的探讨miR-181b在氧糖剥夺(OGD)致N2As神经瘤细胞缺血损伤中的作用,及其对热休克蛋白(HSP)A5表达的调节。方法应用N2A细胞OGD模型模拟神经细胞缺血损伤,MTT比色法检测N2A细胞生存率,免疫印迹法检测HSPA5蛋白表达水平,实时定量PCR法检测miR-181b和HSPA5 mRNA表达水平,荧光素酶报告基因技术检测miR-181b对HSPA5 mRNA的直接调控作用。结果 miR-181b在OGD致N2A细胞缺血损伤中表达水平明显降低(n=5);在OGD致N2A细胞缺血损伤过程中,通过上调或抑制miR-181b的表达水平可以显著影响N2A细胞的生存率(n=6);而在非OGD条件下,miR-181b表达水平的改变对N2A细胞活力无影响;miR-181b表达水平的改变可显著影响HSPA5蛋白表达水平(n=3),而非HSPA5的mRNA水平;共转染miR-181b前体(premiR-181b)或miR-181b抑制剂(anti-miR-181b)可显著抑制或增高含有HSPA5 mRNA 3’-UTR的荧光素酶报告基因的活性(n=5)。结论 miR-181b通过负性调节HSPA5的蛋白表达水平,在OGD致N2A神经细胞缺血性损伤中发挥重要作用。

GM-1预处理减轻布比卡因诱导的N2a细胞凋亡

目的研究单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM-1)预处理对布比卡因诱导N2a细胞凋亡后对c-Jun氨基末端激酶(JNK)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)表达的影响。方法体外培养小鼠神经母细胞瘤细胞N2a细胞株,取对数生长期N2a细胞,将细胞随机分为四组:对照组(C组),N2a细胞无任何药物处理;GM-1组(G组),N2a细胞中加入GM-15μmol/L处理24 h;布比卡因组(B组),N2a细胞中加入布比卡因900μmol/L处理36 h;GM-1预处理组(GB组),GM-15μmol/L预处理24h后,N2a细胞中加入布比卡因900μmol/L处理36 h。以倒置显微镜观察细胞形态学变化,采用TUNEL法检测细胞凋亡率,采用qRT-PCR法和Western blot法分别检测细胞内JNK和CHOP mRNA表达量及蛋白含量。结果与C组比较,B组和GB组细胞损伤形态明显加重,凋亡率明显升高,JNK和CHOP mRNA表达量及蛋白含量明显升高(P<0.05)。与B组比较,GB组细胞损伤形态明显减轻,凋亡率明显下降,JNK和CHOP mRNA表达量及蛋白含量明显降低(P<0.05)。结论GM-1预处理通过调控内质网应激凋亡途径中相关蛋白JNK和CHOP的表达,从而减少布比卡因诱导的细胞凋亡,减轻布比卡因引起的神经毒性。

抑制beclin-1信号通路对缺血再灌注后神经母细胞瘤N2a细胞自噬的影响

目的观察抑制beclin-1信号通路对缺血再灌注后神经母细胞瘤N2a细胞自噬的影响。方法体外培养神经母细胞瘤系N2a细胞,脂质体转染beclin-1的miRNA干扰质粒,以缺氧、缺营养方式模拟缺血再灌注,甲基噻唑基四唑法检测各组N2a细胞活性,免疫印迹法测定各组N2a细胞beclin-1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(Caspase3)的表达,电镜观察该细胞自噬活性。结果在缺血90min、再灌注24h干扰组较相应假干扰组细胞活性明显升高(P<0.05);干扰组beclin-1和Caspase3表达水平明显低于相应的假干扰组(P<0.05),但两组之间LC3表达无明显差异(P>0.05);而在缺血30min再灌注24h细胞活性,beclin-1、Caspase3和LC3的表达真假干扰组间无明显差异(P>0.05)。电镜下在正常组没有观察到细胞自噬现象;在缺血30min和90min再灌注24h,真假干扰组均观察到明显的细胞自噬现象,且两组间无明显差异。结论缺血90min,再灌注24h时,干扰beclin-1的表达虽不能明显改变N2a细胞自噬水平,却减少了凋亡,有利细胞存活。

朊蛋白多肽PrP106-126对小鼠成神经瘤细胞N2a的毒性研究

采用Annexin V-FITC/PI双重染色的流式细胞检测和细胞凋亡的形态学观察,探讨了朊蛋白多肽PrP106-126对小鼠成神经瘤细胞系N2a细胞的毒性作用。结果表明:15、25和50μmol/L浓度的PrP 106-126作用于N2a细胞24 h均引起了细胞明显的形态学变化,提高了细胞凋亡率(P<0.05),且浓度越大,凋亡效果越明显;在浓度为25μmol/L时,PrP 106-126作用N2a细胞48 h引起的毒性作用明显大于24 h,而100μmol/L PrP 106-126作用N2a细胞12 h并未引起细胞凋亡(P>0.05)。试验还表明PrP 106-126对神经细胞产生的毒性是淀粉样纤维物质作用细胞逐渐造成的结果。

miR-378负性调节caspase-3蛋白表达减轻氧-糖剥夺致小鼠N2A细胞缺血损伤

目的探讨miR-378在氧-糖剥夺(OGD)致小鼠成神经瘤N2A细胞缺血损伤中的作用及其可能分子机制研究。方法离体培养N2A细胞,采用3 h OGD/24 h复糖复氧模拟缺血/再灌细胞模型,3-(4,5-二甲基噻唑)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)比色法检测N2A细胞生存率,蛋白印迹(Western blot)检测caspase-3蛋白表达,实时定量RT-PCR检测miR-378和caspase-3 mRNA表达,荧光素酶报告基因验证miR-378对caspase-3 mRNA 3'非翻译区(UTR)的直接调控作用。结果 miR-378在N2A细胞内表达水平,随着3 h OGD复糖复氧时间的增加,而显著降低(P<0.05,n=5);在3 h OGD/24 h复糖复氧致N2A细胞缺血损伤中,上调或下调miR-378的表达水平可显著提高或降低N2A细胞生存率(P<0.05,n=6);而在非OGD条件下,miR-378表达水平改变对N2A细胞生存率则无明显影响;同样,在3 h OGD/24 h复糖复氧条件下,miR-378表达水平的改变可显著影响caspase-3蛋白表达(P<0.05,n=3)而非caspase-3 mRNA表达水平;共转染pri-miR-378可显著抑制含caspase-3 mRNA 3'-UTR的荧光素酶报告基因的表达(P<0.05,n=6)。结论 miR-378可通过负性调节caspase-3蛋白表达水平,来减轻OGD致N2A细胞缺血损伤,所获实验结果有助于从miRNAs水平为缺血性脑卒中提供潜在的治疗靶点。

谷氨酸受体调节剂对N2a细胞中DISC1及Camk2γ的影响

目的观察谷氨酸受体调节剂对小鼠神经瘤N2a细胞中精神分裂症断裂基因1(DISC1)及钙/钙调素依赖性蛋白激酶2γ(Camk2γ)的影响。方法将N2a细胞随机分为4组(n=6),分别加入DMSO(D组,对照组)、1μmol/L氯胺酮(K组)、2μmol/L MK-801(M组)及2μmol/L NBQX(N组)。采用Western blotting检测DISC1及Camk2γ表达。结果与D组相比,K组及M组DISC1表达下调,N组DISC1表达上调(P<0.05);K组及M组Camk2γ下调,N组Camk2γ下调(P<0.05)。结论谷氨酸受体调节剂影响小鼠神经瘤N2a细胞中DISC1及Camk2γ的表达,这可能与谷氨酸受体调节剂诱发精神分裂样不良反应有关。

神经节苷脂预处理对布比卡因诱导N2a细胞焦亡的影响及其机制

目的观察神经节苷脂(GM-1)预处理对布比卡因诱导N2a细胞焦亡的影响,并探讨其机制。方法取对数生长期N2a细胞随机分为3组:布比卡因组(B组)加入终浓度为900μmol/L的布比卡因培养24 h,GM-1预处理组(G+B组)加入5μmol/L GM-1预处理24 h后再加入900μmol/L的布比卡因继续培养24 h,对照组(C组)不加入GM-1或布比卡因。取各组细胞,分别用倒置相差显微镜、扫描电镜观察各组细胞形态;采用CCK-8法测算细胞存活率,以细胞存活率表示细胞活力;采用TUNEL染色试验测算TUNEL染色阳性细胞率,以TUNEL染色阳性细胞率表示细胞凋亡率;采用乳酸脱氢酶(LDH)释放实验测算各组细胞中LDH含量;采用天冬氨酰特异性半胱氨酰蛋白酶1(Caspase-1)活性实验测算各组细胞中Caspase-1活性;采用Western blotting法检测各组细胞焦亡相关蛋白细胞炎症小体活化蛋白质-gasdermin D(GSDMD)、NOD样受体蛋白3(NLRP3)和Caspase-1蛋白表达量。结果C组细胞胞体形态多样且饱满、形态规则,细胞膜完整且光滑;B组细胞皱缩变圆,细胞突触折断、消失,产生凋亡小体样的细胞突起囊泡;G+B组细胞损伤形态明显减轻,未见细胞膜的完整性丧失及微孔形成。与C组相比,B组细胞活力下降,细胞凋亡率升高,LDH含量升高,Caspase-1活性升高,GSDMD、NLRP3、Caspase-1蛋白相对表达量均升高(P均<0.05);与B组相比,G+B组细胞活力升高,细胞凋亡率下降,LDH含量下降,Caspase-1活性下降,GSDMD、NLRP3、Caspase-1蛋白相对表达量均降低(P均<0.05)。结论布比卡因可通过提高N2a细胞膜通透性,导致细胞活力下降、LDH释放、Caspase-1活性和细胞凋亡率升高,促进细胞焦亡,其机制可能与GSDMD,NLRP3,Caspase-1蛋白相对表达量升高有关;GM-1预处理可抑制布比卡因诱导的N2a细胞焦亡过程,其机制可能与降低GSDMD、NLRP3、Cas⁃pase-1蛋白相对表达量有关。

脂氧素A4对Aβ_(25-35)所致N2a细胞损伤的保护作用初探

目的:初步探讨脂氧素A4(LXA4)对β-淀粉样蛋白25-35(Aβ_(25-35))损伤N2a细胞的保护作用及其机制。方法:用不同浓度Aβ_(25-35)处理N2a细胞,建立阿尔茨海默病(AD)细胞损伤模型,通过细胞形态学观察、CCK-8法和Hoechst 33258染色来评价细胞模型是否构建成功。细胞分为对照组、模型组(20μmol/L Aβ_(25-35))和LXA4保护组(50、100、200 nmol/L)。采用CCK-8法检测N2a细胞的活性;荧光酶标仪检测N2a细胞内活性氧(ROS)水平;ELISA法检测细胞培养上清中白介素-10(IL-10)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。结果:20μmol/L Aβ_(25-35)处理N2a细胞24 h可建立细胞损伤模型。LXA4保护组的细胞存活率均较模型组显著升高。与模型组相比,200 nmol/L LXA4保护组细胞内ROS水平显著降低(P<0.01);200 nmol/L LXA4保护组IL-10水平显著高于模型组(P<0.01);200 nmol/L LXA4保护组的TNF-α水平显著低于模型组(P<0.01)。结论:LXA4对Aβ_(25-35)损伤N2a细胞具有保护作用,其机制可能是抑制ROS水平以及调节炎症因子的表达。

AKT-糖原合成激酶-3β信号通路对SOD1G93A突变N2a细胞的保护作用

目的探讨AKT-糖原合成激酶-3β(GSK-3β)信号通路对SOD1G93A突变N2a细胞的作用及机制。方法选取小鼠成神经瘤细胞系N2a,分别转染p EGFP-WT-SOD1和p EGFP-G93A-SOD1质粒,应用Western blotting和免疫荧光染色方法检测AKT、GSK-3β和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)在细胞模型中的表达变化。应用RT-PCR和Western blotting技术检测siRNA沉默AKT后GSK-3β和cyclin D1在SOD1突变N2a细胞中的表达变化,通过MTS方法,检测细胞增殖和存活的改变。结果与p EGFP-WT-SOD1转染的N2a细胞比较,p EGFP-G93A-SOD1转染的N2a细胞中AKT及GSK-3β总蛋白在转染后24 h和48 h表达均无明显变化,p-AKT(Ser473)、p-GSK-3β(Ser9)和cyclin D1表达均升高。免疫荧光染色结果显示,转染后24 h和48 h,p-AKT(Ser473)、p-GSK-3β(Ser9)和cyclin D1在p EGFP-G93A-SOD1转染的N2a细胞中表达均升高。应用siRNA沉默AKT后与对照组相比,在转染后48 h和72h,AKT、p-AKT(Ser473)、GSK-3β、p-GSK-3β(Ser9)和cyclin D1蛋白均降低。MTS实验结果显示,在AKT沉默后72h、96 h、120 h,N2a细胞增殖和活力降低。结论 SOD1G93A突变影响N2a细胞中AKT、GSK-3β翻译后磷酸化修饰及cyclin D1的表达,AKT可能通过调控GSK-3β和cyclin D1影响SOD1G93A突变N2a细胞的增殖和存活。

N2a细胞增殖的痒病小鼠适应毒株RML的致病特性分析

为鉴定细胞体外增殖的痒病小鼠适应毒株RML的致病特性,包括致病性和株系特征等,用RML感染的N2a(Sc-N2a)细胞裂解物接种C57BL/6J小鼠进行研究。结果显示:经(200±28)d的潜伏期后,C57BL/6J小鼠全部发病死亡,临床症状均表现为共济失调,而接种N2a细胞裂解物的C57BL/6J小鼠与接种Sc-N2a细胞裂解物的PrP基因敲除小鼠均正常存活。Sc-N2a细胞增殖的PrPSc与发病小鼠脑组织中PrPSc具有同样的糖基化模式,三种糖基化PrPSc具相同的迁移率,而且均是以单糖基化形式为主。发病小鼠的病理学研究结果显示:脑部的海绵状空泡主要分布于脑干、大脑、小脑、丘脑;脑部的PrPSc主要分布于大脑皮质、海马、丘脑,在小脑、四迭体、嗅球有少量的分布。小鼠回归试验表明:Sc-N2a细胞增殖的PrPSc对小鼠具致病性,并保留RML的株系特征,是TSEs研究的理想细胞模型。

S100A4蛋白对N2a细胞突起生长及骨架蛋白Tubulin聚合的影响

目的:观察S100A4蛋白对N2a细胞突起生长及细胞内骨架蛋白tubulin聚合的影响。方法:在N2a细胞培养基中加入S100A4蛋白(A组)或DMSO(B组),使其终浓度为5μmol/L,观察0、12、24及36h时间点N2a细胞突起的生长情况,测量突起长度,采用免疫印迹法检测N2a细胞内骨架蛋白tubulin的聚合情况。结果:2组孵育12h时,N2aA组细胞胞体均增大,部分细胞长出短小突起差异无统计意义;24h时,A组的大部分N2a细胞生长出2～5个突起,平均突起长度较B组更长(P<0.05);36h时A组部分N2a细胞突起交织成网络,且较B组发达(P<0.05)。免疫印迹检测显示,A组N2a细胞12、24及36h,细胞浆内未聚合的tubulin含量较0h时减少(P<0.05),而B组N2a细胞内未聚合tubulin含量无明显改变。结论:S100A4蛋白能增加胞浆内骨架蛋白tubulin的聚合,促进N2a细胞突起的生长。

PrP106-126诱导的小鼠成神经瘤N2a细胞NF-κB激活及神经毒性研究

PrP106-126诱导的神经毒性机制仍不清楚。作者以小鼠成神经瘤细胞N2a为细胞模型,应用WesternBlot方法首次发现PrP106-126导致核转录因子NF-κB的亚单位p65蛋白转移到细胞核内,激活了NF-κB细胞信号分子。转核抑制剂NF-κB SN50预处理细胞减弱了PrP106-126诱导的NF-κB激活程度;并且DNA Ladder凋亡检测及Annexin V-FITC和PI双染流式细胞凋亡检测发现,NF-κB SN50能够抑制p65蛋白转核,在一定程度上也抑制了PrP106-126对N2a细胞的神经毒性效果。结果表明NF-κB信号分子参与了PrP106-126的神经毒性,且NF-κB信号分子的激活对N2a细胞具有促凋亡作用。PrP106-126激活N2a细胞NF-κB信号分子以及NF-κB促凋亡功能的体外研究对于阐明朊病毒病致病机理具有重要意义。

PrP106-126诱导的N2a细胞神经毒性中神经营养因子受体p75^NTR的表达变化研究

神经元死亡是朊病毒病的主要病理学特征。朊蛋白多肽PrP106-126能够对神经细胞表现神经毒性,引起细胞凋亡。细胞表面蛋白神经营养因子受体p75NTR的胞外区域可以与PrP106-126结合并产生促凋亡作用。作者以小鼠成神经瘤细胞N2a为细胞模型,应用荧光定量RT-PCR和Western Blot技术,以及DNA Ladder和AnnexinV-FITC/PI双重染色流式细胞凋亡检测技术对p75NTR介导的PrP106-126神经毒性分子机制进行了研究。结果发现在PrP106-126诱导的N2a细胞凋亡过程中,p75NTR的mRNA转录水平和蛋白表达水平均显著升高,以p75NTR多克隆抗体sc-6189阻断PrP 106-126与p75NTR的相互作用后,减弱了PrP106-126诱导的N2a细胞凋亡效果。该研究揭示了PrP106-126诱导的N2a细胞毒性中p75NTR受体的表达变化,为解释朊病毒病的发病机制提供了重要数据。

热休克蛋白40和热休克蛋白70抑制N2a细胞内突变亨廷顿蛋白聚积和毒性

目的研究热休克蛋白40（HSP40）和热休克蛋白70（HSP70）对N2a细胞内突变亨廷顿蛋白（htt）聚集物形成和毒性的影响。方法应用荧光显微镜术和免疫印迹技术检测单独或共同过表达HSP40和HSP70对N2a细胞内转染的突变htt（含有150个谷氨酰胺重复数,150Q）聚集物形成的影响;应用四甲基偶氮唑盐（MTT）法分析细胞活力和比色法检测细胞内活性氧（ROS）含量。结果单独过表达HSP40或HSP70,尤其是共同过表达HSP40和HSP70显著减少150Q htt在N2a细胞内的聚积,各组含有聚集物的细胞为（n=1 000）：仅表达150Q htt组约50%,过表达HSP40组约12%,过表达HSP70组约15%,共同过表达HSP40和HSP70组约5%。MTT分析结果显示,单独尤其是共同过表达HSP40和HSP70能显著增加150Q细胞的活力（P＆lt;0.01,n=3）,同时减少ROS产生（P＆lt;0.01,n=3）。结论HSP40和HSP70通过抑制细胞内突变htt聚积以及减少氧化应激而增加150Q N2a细胞活力。

PACS-2在阿尔茨海默病发展中作用机制研究

目的探究磷酸呋喃酸性簇分选蛋白-2(phosphofurin acidic cluster sorting protein-2,PACS-2)在N2a/APP695swe细胞线粒体功能及细胞凋亡中的参与作用,进一步探讨PACS-2在阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)发生、发展中的作用及意义。方法CCK8法分析不同浓度的二苯乙烯苷(tetrahydroxy stilbeneglycoside,TSG)处理N2a/APP695swe细胞48h后的细胞存活率,选择合适浓度的TSG用于后续实验。体外常规培养N2a/WT细胞和N2a/APP695swe细胞,实验细胞分为3个组:空白对照组(WT组):N2a/WT细胞;模型组(APP组):N2a/APP695swe细胞;治疗组(TSG组):N2a/APP695swe细胞,合适浓度的TSG干预。TUNEL法荧光显微镜观察细胞凋亡情况,JC-1法流式检测细胞线粒体膜电位,Westernblot(WB)检测PACS-2的蛋白表达情况,RT-qPCR检测PACS-2的mRNA表达情况。结果CCK8法分析不同浓度的TSG作用细胞48h后的细胞存活率:100μmol/L的TSG保护作用最显著,差异有统计学意义(P<0.01);TUNEL法荧光显微镜观察细胞凋亡情况,与WT组相比,APP组的凋亡率升高,与APP组相比,TSG组的凋亡率降低,差异有统计学意义(P<0.05);JC-1法检测细胞线粒体膜电位;与WT组相比,APP组的膜电位降低,与APP组相比,TSG组膜电位升高,差异有统计学意义(P<0.05);WB检测PACS-2的蛋白表达:与WT组相比,APP组的PACS-2表达升高,与APP组相比,TSG组的PACS-2表达降低,差异有统计学意义(P<0.05);RT-qPCR检测PACS-2的mRNA表达:与WT组相比,APP组的PACS-2表达升高,与APP组相比,TSG组的PACS-2表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论PACS-2在AD的发生、发展中有重要作用,其上调可能促进AD的发生,脑保护药物TSG可能通过下调PACS-2抑制AD模型细胞凋亡并改善线粒体功能发挥细胞保护作用。

FoxO3a介导药根碱保护N2a-SW模型中损伤线粒体机制的初步探讨

目的探讨Fox O3a介导药根碱(JAT)保护稳转APP695swedish基因的小鼠神经瘤N2a细胞(N2a-SW)模型中损伤线粒体的机制。方法以小鼠神经瘤N2a细胞为对照组,N2a-SW细胞为AD模型组,应用不同浓度JAT进行处理后,检测JAT对模型组损伤线粒体中Fox O3a、m RNA及线粒体相关蛋白的表达影响。结果与N2a组相比较,SW模型组细胞形态呈明显损伤形态、细胞中Aβ蛋白表达增加至(176.01±17.47)%、细胞内活性氧ROS聚集升高至(264.14±8.93)%;与SW组相比,应用20μmol/L、40μmol/L JAT处理SW细胞24 h后,可以降低ROS水平分别至(170.06±8.20)%、(100.51±11.81)%;与SW组相比,不同浓度JAT(10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L)处理组不仅可以减少细胞色素C(Cyto-c)在胞浆中的释放[分别为(66.71±7.88)%、(67.99±6.89)%、(56.64±5.99)%],降低线粒体分裂调节蛋白Drp1的表达[分别为(67.62±5.87)%、(56.99±3.62)%、(38.00±10.16)%],还可抑制SW组Fox O3a磷酸化蛋白表达[分别为(66.49±3.11)%、(42.14±1.94)%、(51.12±4.55)%],并增加线粒体核心蛋白PGC1α的表达[分别为(201.51±12.43)%、(179.43±1.77)%、(157.80±16.32)%]及m RNA的表达[分别为(162.46±5.98)%、(244.92±2.67)%、(149.11±4.76)%],而总蛋白Fox O3a及m RNA不受影响,上述结果差异均有统计学意义(P<0.05)。结论JAT可能通过Fox O3a来发挥对阿尔茨海默病损伤线粒体的保护作用。