高效液相色谱法测定骨骼肌ATP、ADP、AMP、NAD^+、NADH含量

采用高效液相色谱法测定骨骼肌腺嘌呤核苷酸和辅酶Ⅰ含量。高压液相系 统包括：惠普公司ＺＯＢＡＸ－Ｃ１８反相柱５ｍｍ×１２ｃｍ，５９０ＵＶ检测器。流动相为２２０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸钾缓冲液，内含１０％甲醇，用四丁基氢氧化胺ＴＢＡＨ调ｐＨ至６５。等比洗脱，流速为０８ｍｌ／ｍｉｎ。检测波长为２５４ｎｍ。所有样品和标准品在进样前均用０４５μｍ孔径的虑膜过滤后进样５μｌ作色谱分析。结果表明：ＨＰＬＣ可以同时测定ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＨ，分离效率高，操作简便，快速每个样品仅需１５分钟，而且，重现性好，定性可靠，定量准确。

NAD^+/NADH代谢机制研究进展

NAD+/NADH是细胞能量代谢所必需的辅酶,小到细胞的各种生命活动,大到整个生命结构的平衡,都需要能量来维持。同时,细胞的氧化还原状态,特别是NAD+/NADH的水平直接影响着细胞的节律、衰老、癌变和死亡等重大生命过程。故而有关细胞内NAD+或NADH代谢的研究近年在国际上形成了一个新的热点。我们以NAD+/NADH代谢为重点,综述国内外关于该机制的研究现状。

过量表达NADH氧化酶加速光滑球拟酵母合成丙酮酸

【目的】进一步提高光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)发酵生产丙酮酸的生产强度。【方法】将来源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中编码形成水的NADH氧化酶noxE基因过量表达于丙酮酸工业生产菌株T.glabrata CCTCCM202019中,获得了一株NADH氧化酶活性为34.8U/mg蛋白的重组菌T.glabrata-PDnoxE。【结果】与出发菌株T.glabrata CCTCC M202019相比,细胞浓度、葡萄糖消耗速率和丙酮酸生产强度分别提高了168%、44.9%和12%,发酵进行到36h葡萄糖消耗完毕。补加50g/L葡萄糖继续发酵20h,则使丙酮酸浓度提高到67.2g/L。葡萄糖消耗速度和丙酮酸生产强度增加的原因在于形成水的NADH氧化酶过量表达,导致NADH和ATP含量分别降低了18.1%和15.8%,而NAD+增加了11.1%。【结论】增加细胞内NAD+含量能有效地提高酵母细胞葡萄糖的代谢速度及目标代谢产物的生产强度。

采用NADH／NAD＋法分析餐厨垃圾厌氧消化系统失衡过程中微生物代谢状态

运用NADH/NAD^+技术对餐厨垃圾厌氧消化系统内微生物代谢状态进行动态追踪。厌氧消化系统负荷OLR从2.0kg VS/(m^3·d)到8.5kg VS/(m^3·d)整个运行过程中,在不同负荷条件下取样进行NADH/NAD^+分析。实验结果表明:在厌氧消化末期,厌氧消化的NADH/NAD^+的数值急剧的升高,最高达1.36,可以判定厌氧消化系统内的微生物系统代谢平衡崩溃。

乙醇发酵中酿酒酵母辅酶NAD^+及NADH测定方法

乙醇发酵过程中酿酒酵母细胞辅酶NAD+和NADH质量分数及其比例反映了胞内的氧化还原状态和细胞代谢活性,具有重要的生理意义。作者主要研究了加热萃取、珠磨破碎、反复冻融破碎3种方法对乙醇发酵过程酿酒酵母细胞辅酶NAD+和NADH提取和测定的影响,提出基于珠磨破碎、辅以加酸或碱并加热的萃取模式,以及合适的酶循环反应体系,从而建立了高效的胞内NAD+和NADH检测方法。

调控NADH/NAD^+对重组谷氨酸棒杆菌产L-丝氨酸的影响

在谷氨酸棒杆菌中,L-丝氨酸由糖酵解中间产物3-磷酸甘油酸经过3步反应生成,这个过程产生2个NADH,而L-丝氨酸的合成过程并不涉及NAD^+的生成,多余的NADH是否会影响菌株的生长及产L-丝氨酸?该研究通过外源添加NAD^+的前体物质烟酸,内源表达NADH氧化酶编码基因nox A,考察调控NADH/NAD^+对Corynbacterium glutamicum SYPS-062 33aΔSSAAI生长和产L-丝氨酸的影响。结果表明,添加不同浓度烟酸,菌株的L-丝氨酸产量、生物量及糖耗较未添加时略有提高。而通过加强表达NADH氧化酶编码基因nox A,构建重组菌Corynbacterium glutamicum SYPS-062 33aΔSSAAI-nox A,重组菌中NADH氧化酶比酶活是出发菌的11.6倍,L-丝氨酸产量达到28.93 g/L,较出发菌提高9.0%,糖酸转化率达到0.29 g/g蔗糖,较出发菌提高7.4%,OD562最大值为51.38,较出发菌提高6.6%,说明NADH氧化酶的过表达能够促进重组菌株的生长及碳源利用,提高菌株的L-丝氨酸产量。

NADH氧化酶的研究进展

NADH氧化酶是一类催化NADH氧化为NAD+并消耗氧气的氧化还原酶,因其能够再生NAD+而成为人工调控微生物代谢流向的重要调控酶.文中综述了NADH氧化酶的分类、理化性质、反应机制,并分析NADH氧化酶清除细胞内氧毒性、介入细胞代谢过程,以及调节细胞生理和代谢等重要的生理功能.

乙醇脱氢核酶ribox02与NAD＋／NADH结合位点的探测

目的探讨乙醇脱氢核酶ribox02与NAD^+、NADH特异性结合的位点以及结合力性质。方法通过选择性2-OH酰基化学探测法(selective 2-hydroxyl acylation analyzed by primer extension,SHAPE)探测ribox02的二级结构;利用等温滴定量热法(isothermal titratio calorimetry,ITC)进一步测定ribox02与NADH、NAD^+的亲和力强度及作用力性质;通过紫外交联法精确定位NAD^+、NADH与ribox02 RNA的特异性结合位点。结果直接解析ribox02的二级结构,并发现核酶ribox02与NADH、NAD^+的相互作用力为范德华力或氢键作用,且ribox02与NADH的相互作用力较之与NAD^+更为强烈,ribox02与NADH、NAD^+的特异性结合位点为23G、24U、25U、38U、72U、73U、74U、75G和95G。结论通过ribox02的二级结构及其与NAD^+、NADH的相互作用揭示了核酶ribox02与NAD^+/NADH特异性结合位点以及结合力性质。

基于NAD^+/NADH比率荧光探针的乳酸检测法

结合氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+/NADH)比率荧光探针SoNar与酶法分析技术,建立了一种灵敏的乳酸检测方法,并进一步对影响检测性能的几个因素,如pH、温度、底物浓度、SoNar浓度等进行了优化.结果显示,该方法的检测限(LOD)为2.60μmol/L,定量限(LOQ)为8.67μmol/L,不同时间重复测定的标准偏差(RSD)为2.37%,乳酸质量浓度0~1000μmol/L范围内的Z因子值为0.82,表明该方法具备很好的稳定性和重复性.与目前常用的基于MTT-PMS的酶偶联分析法相比,本文所建立的乳酸检测法灵敏度更高,特异性更好,且生物兼容性更强.

NAD(H)调控线粒体功能在疾病中的作用

线粒体是细胞内最重要的细胞器之一,不仅作为能量合成器在细胞代谢中发挥着重要作用,也通过介导SIRTs、PARPs等多种酶的功能参与细胞信号传导。NAD(H)是活细胞中的辅酶,可作为线粒体的调控因子广泛参与调节细胞生长、分化、能量代谢、凋亡等生物学过程,从而影响疾病的发生与发展。本文综述NAD(H)调控线粒体功能的分子机制,并简述NAD(H)的合成、消耗与检测方法,阐述其在神经系统变性疾病、衰老、肿瘤和心血管疾病等状态下的调控机制和潜在的药物靶点特性,旨在为NAD(H)介导的疾病预防和诊疗提供新的思路。

从头算分析NAD^+及NADP^+的电子传递

用HF从头算计算NAD+及NADP+及其还原产物NADH及NADPH分子的绝对能量、电荷分布、前线轨道能量、偶级距、键长、电子自旋伸展空间,并讨论了空间构形与电子传递的关系,提出了NAD+及NADP+在电极和生物氧化过程中传递电子的机理.

厌氧发酵有机酸体系中NAD+和NADH测定方法的建立

建立一种酶法高效测定厌氧发酵有机酸体系中NAD+和NADH的方法。利用酶循环机理,以1.0 mol/L Bicine buffer(pH8.0)、纯乙醇、40 mmol/L EDTA(pH8.0)、4.2 mmol/L MTT、16.6mmol/L PES和50μL的乙醇脱氢酶作为混合反应体系,采用紫外可见分光光度计在570 nm处测定吸光值变化情况,能将发酵体系中的NAD+和NADH准确定量,检出限分别为1.3×10-6 mol/L和5.9×10-6 mol/L,回收率分别在94%～98%和96%～101%范围内。能够快速、精确测定厌氧发酵体系中的NAD+和NADH含量,对于指导厌氧发酵体系辅酶代谢调控分析具有重要意义。

微生物法生产1,3-丙二醇的基因工程研究进展

基因工程研究在生物法生产化工产品的过程中扮演着越来越重要的角色,对生物法生产1,3-丙二醇研究中利用基因工程手段对于菌体以及代谢途径进行改造的研究进行了考察,综述了其最新应用情况及其进展,并展望了未来的发展趋势。

乳酸盐代谢及其在健康中的关键作用

为什么乳酸菌及其发酵食品往往有利于健康?或许这正是由于其产乳酸盐的作用。乳酸盐代谢已经得到了生理和生物化学家的广泛关注。然而,20世纪的前叶,乳酸盐还一直被作为废物,特别是作为肌肉疲劳的罪魁祸首。但是最近,越来越多的研究结果证明,乳酸盐在多细胞有机体中发挥了关键性作用。已经证明乳酸有多种生理功能,可以作用于机体的激素释放、调节多种酶活性,控制机体代谢平衡。此外,这些特性还直接关系到病理作用的发生和发展,如糖尿病和癌症。乳酸盐不能简单地认为是一种厌氧发酵产物,其实更应该把它作为一个调节分子,可以调节和整合多条代谢途径。虽然乳酸盐本身并不是一种具氧化还原作用的化合物,但是,它作为一种重要的中间代谢产物参与了糖酵解、生物氧化和生物合成。乳酸盐在胞浆中由糖酵解途径合成,通过和丙酮酸之间的互相转化与NADH/NAD+偶联,由乳酸脱氢酶催化。所以乳酸盐在NADH/NAD+、pH值、ATP、生物氧化与合成的动态平衡中发挥着重要作用。也正是因为这些生物活性,乳酸盐已经被广泛应用于发酵和功能性食品生产、肉类食品质量保护和护色、防癌、抗癌;同时,乳酸盐还是生理变化、应激和病理评估的理想标志物。

不同强度运动时大鼠骨骼肌能量代谢产物的变化

本研究旨在观察不同强度运动时 ,与能量代谢有关的骨骼肌腺嘌呤核苷酸 (ATP)、磷酸肌酸 (CP)、乳酸 (LA)和呼吸链氧化还原的变化特点 ,以进一步阐明训练中运动强度这一重要因素的生理意义。雄性SD大鼠先经 5周耐力训练筛选 ,再进行 3周递增速度训练。正式实验时 ,随机分成 6个强度组 (0m/min、18m/min、30m/min、4 2m/min、5 4m/min、6 6m/min) ,6只 /组 ,每组以 6m/min的增幅进行 3分钟准备活动 (0m/min组为安静时处死 ) ,然后以预定强度跑 3分钟后立即处死 ,取右腿用液氮固定 ,凿取腓肠肌 ,经冷冻干燥后制备肌肉提取液。用高效液相法测定肌肉ATP、ADP、AMP、CP、NADH和NAD+ ,用紫外分光法检测肌乳酸。结果表明 ,随着运动强度的增加 ,运动后即刻大鼠腓肠肌能量代谢产物的变化如下 :(1)ATP浓度在 18～ 4 2m/min范围内呈下降趋势 ,超过 4 2m/min出现上升趋势 ,其中 ,4 2m/min组比安静组降低 (P <0 0 1) ,5 4m/min组较 4 2m/min组升高 (P <0 0 5 ) ;ADP和AMP的变化表现为波动性上升的趋势 ;CP浓度、能荷 (EC)以及ATP/ADP的比值呈波动性下降趋势 ;同时 ,随着ATP/ADP比值的下降 ,AMP的生成增加 ,CP逐渐降解。(2 )肌乳酸、NADH和NADH/NAD+ 比值呈波动性上升趋势 ,当强度大于 4 2m/min时NADH/NAD+明显上升 ,

丁酸型发酵产氢的运行稳定性

着重对发酵法生物制氢反应系统的丁酸型发酵的运行稳定性进行了研究分析。结果表明,在有机负荷大于21kgCOD/m3·d的条件下,丁酸型发酵具有不稳定性,在负荷冲击下容易转变为丙酸含量较高的发酵类型,从而导致系统产氢能力的下降。分析认为,NADH/NAD+的平衡调节能力是影响系统运行稳定性的一个关键因素。在高负荷条件下,由于丁酸型发酵的产丁酸过程不能氧化过剩的NADH+H+,导致产乙酸过程生成的剩余NADH+H+在系统内大量积累,使反应系统难以达到氧化还原的平衡状态,最终影响了系统的稳定运行。

荧光猝灭法研究NADH、Thio-NAD^+与3α-HSD的相互作用

采用荧光猝灭法研究了两种辅酶,还原型烟酰胺嘌呤二核苷酸(NADH)、氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NAD+)与3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)的相互作用。研究结果表明,NADH和Thio-NAD+的加入均能使3α-HSD的内源性荧光发生猝灭,其猝灭机制均属于生成复合物的静态猝灭;25℃下NADH、Thio-NAD+与3α-HSD的结合常数分别为7.38×104、1.23×104L.mol-1;37℃下NADH、Thio-NAD+与3α-HSD的结合常数分别为4.69×104、9.74×103L.mol-1;NADH与3α-HSD的结合作用力为氢键和范德华力,Thio-NAD+与3α-HSD的结合作用力主要为静电引力和疏水作用力;NADH和Thio-NAD+均能使3α-HSD构象发生变化,导致色氨酸残基所处环境极性增大。

不同负荷运动训练对大鼠骨骼肌线粒体三羧酸循环的影响及其机制研究

目的:探讨不同负荷运动训练对大鼠骨骼肌线粒体三羧酸循环的影响及其机制。方法:将雄性Wistar大鼠50只随机均分为5组:安静对照组(C)、低负荷运动训练组(LT)、中等负荷运动训练组(MT)、高负荷运动训练组(HT)和极高负荷运动训练组(ST),每组10只。各运动组分别进行6周的跑台运动训练。训练方案结束后,取腓肠肌样本,提取线粒体,测定线粒体柠檬酸合成酶(CS)、异柠檬酸脱氢酶(ICD)和α—酮戊二酸脱氢酶(α-KGDHC)活性;线粒体Ga^(2+)含量、胞浆NADH、NAD^+、ATP和ADP含量,以及ICD mRNA转录水平。结果:(1)不同负荷运动训练组线粒体CS、ICD和α-KGDHC的活性均显著高于安静对照组(P<0.01),且CS和ICD活性由高到低顺序均为:MT组>HT组>ST组>LT组>C组,α-KGDHC活性由高到低顺序为:HT组>MT组>ST组>LT组>C组。(2)不同负荷运动训练组线粒体Ca^(2+)含量均显著高于安静对照组(P<0.01),其含量由高到低顺序为:MT组>HT组>ST组>LT组>C组;胞浆NADH/NAD^+和ATP/ADP的比值均显著低于安静对照组(P<0.01),其比值由低到高顺序为:MT组<ST组<HT组<LT组<C组。(3)不同负荷运动训练组ICD mRNA转录水平均高于安静对照组(P<0.01),其水平由高到低顺序为:MT组>HT组>ST组>LT组>C组。结论:低负荷、中等负荷、高负荷及极高负荷运动训练均可提高大鼠骨骼肌线粒体三羧酸循环功能,且中等负荷运动训练效果最佳。其机制与胞浆NADH/NAD^+和ATP/ADP比值、线粒体摄钙能力及限速酶基因的表达有关。

超高效液相色谱-质谱联用法同时快速测定细胞中的4种吡啶核苷酸辅酶

建立了超高效液相色谱-质谱联用法同时测定细胞内4种吡啶核苷酸辅酶(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD^(+))和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP^(+))以及它们的还原态(NADH和NADPH))的方法。样品经甲醇低温快速提取后,在新型混合模式Atlantis PREMIER BEH C_(18)AX色谱柱上分离,10 mmol/L甲酸铵-乙腈作为流动相在8 min内完成梯度洗脱分离,采用质谱多反应检测(MRM)模式,负离子[M-H]^(-)扫描检测。对于4种吡啶核苷酸辅酶,本方法均在较宽浓度范围内呈良好线性关系,检出限和定量限分别在0.03~0.30 pmol和0.06~1.20 pmol范围内;检测准确度在92.7%~107.6%之间,相对标准偏差在1.98%~7.57%之间。该方法操作简便、分析快速、准确度高、灵敏度好,适用于人和微生物等多种细胞样品中吡啶核苷酸辅酶的快速定量测定,为细胞生理代谢研究提供可靠的技术支持。

芯片毛细管电泳检测痕量酶活性的初步探讨

微芯片技术是基于微机电加工技术(MEMS)工艺,在芯片上完成电泳检测过程的新型技术.利用自制的微流控芯片及激光诱导荧光系统建立了痕量乳酸脱氢酶(LDH)活性的检测方法.以pH9.4,75mmol/L硼酸为芯片电泳缓冲液,9.73μmol/L乳酸钙为添加剂,整个电泳过程4min结束,利用该法测得LDH检测限(S/N=3)为6×10-3U/L,出峰时间和峰面积的相对标准偏差分别为5.32%和3.17%,该法操作过程简单,检测灵敏度高,在临床痕量酶检测中具有较好的应用前景.