猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30株CHsx1401感染性克隆的构建

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是影响全球养猪业的一种重要病原。近年来,国内新出现的类NADC30毒株导致临床PRRS疫情再次出现。本研究旨在构建PRRSV类NADC30毒株CHsx1401的感染性克隆,以期为研究该类毒株遗传变异与演化以及与其他毒株致病性差异的分子机制奠定基础。将类NADC30毒株CHsx1401全长基因组分为4个片段进行RT-PCR扩增,分别将扩增片段克隆到pJET1.2载体构建中间质粒,将4个克隆依次连接并克隆到改造后的低拷贝质粒载体pWSK29中,构建全长cDNA克隆pWSK-CHsx1401,并在全长cDNA克隆的C与D片段之间通过同义突变(T11582G)引入AscⅠ酶切位点,作为遗传标记,用于区分拯救病毒与亲本病毒。采用脂质体LTX将全长cDNA克隆质粒转染至MARC-145细胞拯救病毒。结果表明,成功构建出全长cDNA克隆pWSK-CHsx1401,转染MARC-145细胞后传至第二代可观察到明显的细胞病变(CPE)。经间接免疫荧光、RT-PCR和序列测定鉴定结果表明,从全长cDNA克隆可拯救出病毒。拯救病毒(RvCHsx1401)在MARC-145细胞上可稳定传代,增殖动态与亲本病毒相似,在MARC-145细胞上各时相的病毒滴度略低于亲本病毒。本研究构建的类NADC30毒株CHsx1401的全长cDNA克隆具有感染性,可拯救出病毒;拯救病毒与亲本病毒的体外增殖特性相似,为研究该毒株的变异与演化以及与其他毒株致病性差异的分子机制提供了技术平台。

2015年、2016年我国部分地区猪群猪繁殖与呼吸综合征的分子流行病学研究

为了解我国部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）流行毒株的遗传变异情况和流行趋势,试验利用RT-PCR方法对2015年、2016年全国超过20个省份的3 078份疑似PRRS病料进行检测,并扩增部分阳性病料的ORF5基因进行测序和遗传变异分析。结果表明：PRRSV阳性样本共889份,阳性率为28.88%。扩增得到177个ORF5的基因序列,通过序列分析发现,我国流行的PRRSV主要为美洲型,其中90份与高致病性PRRSV（HP-PRRSV）高度同源,53份与经典PRRSV高度同源,34份与NADC30-like PRRSV高度同源,其中14份流行毒株的GP5蛋白糖基化位点N34发生缺失。说明监测地区主要流行HP-PRRSV,同时NADC30-like PRRSV已经形成一个相对独立的分支在我国流行,提示有必要加强PRRSV变异毒株的流行和变异的监测,同时对其致病性等生物学特性进行深入研究。