急性早幼粒白血病细胞ATRA耐药株HL-60R、NB4R的构建及鉴定

目的:构建急性早幼粒细胞白血病细胞系HL-60、NB4的全反式维甲酸耐药株HL-60R、NB4R,并对其生物学性状进行鉴定。方法:以全反式维甲酸(ATRA)为诱导药物,采用浓度递增间歇诱导法构建HL-60、NB4细胞相应的ATRA耐药株。CCK8法鉴定其ATRA耐药性,并检测耐药细胞株的生长曲线及多药耐药性。结果:成功构建了ATRA耐药细胞株HL-60R、NB4R,并发现与亲代细胞相比,其生长增殖速度减慢,群体倍增时间延长,且对其它多种化疗药物产生一定程度的交叉耐药。结论:成功构建的耐药细胞系HL-60R、NB4R为急性早幼粒细胞白血病多药耐药机制的进一步研究奠定了基础。

Pkm2-shRNA真核表达载体的构建和对急性早幼粒细胞白血病耐药细胞株的作用研究

本研究旨在构建M2型丙酮酸激酶(M2-pyruvate kinase;PKM2)的小发夹结构RNA(shRNA)的真核表达载体,研究特异性沉默pkm2基因对急性早幼粒细胞白血病(APL)耐药性的影响。设计pkm2基因的3个特异shRNA序列,利用基因重组技术将其克隆到含有U6启动子的PBSU6载体上,通过酶切和测序等方法鉴定重组质粒的正确性。利用Western blot方法检测了pkm2-shRNA对急性早幼粒细胞白血病耐药细胞株NB4R2细胞内源性M2-PK蛋白表达的影响,通过NBT还原实验检测了pkm2基因沉默后NB4R2细胞分化情况。结果表明:成功构建了3个有效特异的pkm2-shRNA,在蛋白水平上证明了其对NB4R2细胞M2-PK基因沉默的有效性。发现干涉M2-PK基因后,可显著地促进耐药细胞NB4R2细胞的分化。结论:DNA载体途径的pkm2-shRNA能促进早幼粒细胞白血病细胞的分化,具有基因靶向药物开发前景。

雄黄诱导急性早幼粒细胞白血病维甲酸耐药细胞株NB4-R1细胞凋亡的蛋白质组学研究

目的 获得并鉴定雄黄（四硫化四砷,As4S4）诱导急性早幼粒细胞白血病（APL）维甲酸耐药细胞株NB4-R1细胞凋亡的差异蛋白质组.方法 运用高分辨二维双向电泳获得As4S4诱导NB4-R1细胞凋亡前后的蛋白质组表达谱,通过凝胶图像分析筛选出差异蛋白,经胶内酶解后应用MALDI-TOF-MS、MALDI-TOF/TOF、UPLC-MS/MS串联质谱技术和生物信息学鉴定差异蛋白.结果 共筛选鉴定出22个表达升高2倍以上或降低50%以上的蛋白质点,最终获得21种已知蛋白,包括在As4 S4作用后表达下调的5种蛋白,分别为SET/I2PP2A、RPP2、PCBP1、EIF4H-1和ANP32A/I1PP2A;在As4S4作用24 h后表达上调的2种蛋白,分别为HSP 27和HMGB1;及在As4S4作用48 h后表达上调的14种蛋白质,分别为PHB、ERP29、DNAJC8、PSMB4、ACTB、RPP0、RhoGDI2、α-tubulin、Transcription factor、RBM15/OTT1、eIF5A1和H2B1M等.结论 筛选鉴定出As4 S4诱导NB4-R1细胞凋亡过程中有21种蛋白差异表达.其中SET、RPP2和PHB可能成为治疗维甲酸耐药APL的新靶点.