线粒体16srRNA和ND4基因在种属鉴定中的应用研究

目的 构建一种用于种属鉴定的线粒体DNA（mtDNA）16srRNA和ND4基因荧光标记复合扩增检测体系。方法 利用引物设计软件（Primer 5）对两个mtDNA序列ND4基因和16srRNA基因设计两对引物，每对引物中的一条在5’端标记荧光素（6-FAM）。按传统复合扩增技术建立复合扩增体系，用ABIPRISM 310基因分析仪对产物进行分析。结果 人类DNA扩增产物出现两个峰，片段大小分别为110bp的人类特异片段和149bp的人与动物共有片段，而动物DNA扩增产物出现一个峰，片段大小为149bp。对30个实验室存放5～15年的陈旧人血痕也能明确判断其种属来源。结论 该体系可以明确区分人源性生物检材与其它常见动物样本，对实验室长期存放的陈旧检材也具有较好的检测能力。

黄颡鱼属两种鱼类的线粒体ND4基因序列变异性分析

以东亚特有种光泽黄颡鱼(Pelteobagrus nitidus)和长须黄颡鱼(Pelteobagrus eupogon)为研究对象,采用PCR技术获得了这两种鱼类的部分线粒体DNA DN4基因及其3′端的tRNA基因碱基共约772个,用MEGA2.1软件分析了此片段序列,采用Kimura双参数模型计算遗传距离,以科属的大鳍(Hemibagrus macropterus)为外类群,用邻接法构建不同水系的光泽黄颡鱼和长须黄颡鱼的分子系统树。不同水系的光泽黄颡鱼的遗传距离在0.000—0.012之间,长须黄颡鱼的遗传距离在0.000—0.003之间,光泽黄颡鱼和长须黄颡鱼种间的遗传距离在0.099—0.108之间,从分子水平上证实了光泽黄颡鱼和长须黄颡鱼为两个有效物种。不同水系的光泽黄颡鱼遗传变异很小,除黑龙江种群外,其他水系的光泽黄颡鱼在分子系统树没有能够按水系区分开来,可能的原因为:(1)不同水系的光泽黄颡鱼之间存在频繁的基因交流;(2)东亚科鱼类的线粒体DNA的进化速率可能较小;(3)人类经济活动可能已影响到光泽黄颡鱼的种群遗传结构。

基于ND4和ND5基因序列分析的鳅超科鱼类系统发育关系

ND4和ND5是线粒体基因组中编码NADH脱氢酶亚基4和亚基5的两个蛋白质编码基因。该研究以鳅超科鱼类为研究对象,新测定了10个物种的ND4和ND5基因全序列以及中间的3个tRNA基因共212bp的序列,结合从GenBank下载的15个物种的15条序列进行序列比较和系统发育关系分析。结果显示:鳅超科鱼类ND4基因全长1380～1387bp,以ATG为起始密码子,终止密码子为不完全终止信号;ND5基因全长1821～1839bp,同样起始密码子为ATG,终止密码子为TAA或TAG;ND4和ND5基因之间插入了3个tRNA基因,分别编码携带组氨酸、丝氨酸、亮氨酸的tRNA。ND4和ND5基因(包含3个tRNA基因)中A、T、G、C的平均含量分别为30.4%、27.3%、14.2%、28.1%,A+T(57.7%)的含量高于G+C(42.3%)的含量。转换与颠换比(Ti/Tv)平均值为1.586。选取斑马鱼和鲤鱼作为外类群,采用最大简约法(MP)、最大似然法(ML)和贝叶斯推断法(BI)进行系统发育树的重建。三种方法的系统发育分析结果都显示:花鳅亚科、条鳅亚科、沙鳅亚科、平鳍鳅科及Vaillantellidae分别构成单系;它们的系统发育关系为:(Vaillantellidae+(沙鳅亚科+(花鳅亚科+(条鳅亚科+平鳍鳅科)。这与线粒体全基因组和某些核基因(如RAG1基因)的研究结果类似,且支持率较高,表明ND4和ND5基因用于鳅超科鱼类的系统发育分析是可行的;但是该研究的结果有别于其他线粒体基因的分析结果,如基于cytb和D-loop基因进行的系统发育分析表明,条鳅亚科和花鳅亚科聚为姐妹群,再和平鳍鳅科聚在一起。这种差异可能是由于使用的基因长度差异造成的,长度越长,信息量越大,所反映的系统发育结果可能更加接近真实情况。

线粒体ND4-ND4L基因在黑腹果蝇种组中的进化特征

本实验对黑腹果蝇种组(melanogaster species group)中8个种亚组33个样品两个线粒体基因ND4和ND4L进行了测序,并分析了ND4基因的序列差异和碱基替换特点,发现近缘物种中存在很明显的转换倾向,而在远缘物种中由于重复替换导致转换数处于饱和状态,我们的实验数据证实了线粒体基因较核基因有较快的进化速度。最后根据D.melanogaster与D.yakuba的遗传距离推算了8个种亚组的分化时间,ananassae种亚组最先分化,然后依次是montium,melanogaster,fic-sphila,eugracilis,elegans,suzukii和takahashii最后分化。

登革热媒介白纹伊蚊mtDNA-ND4基因特征分析

目的研究不同地理种群白纹伊蚊(Aedes albopictus)线粒体蛋白NADH脱氢酶亚基Ⅳ(mtDNA-ND4)基因多态性,探讨其遗传特征。方法采集不同海拔高度、登革热历史流行区与非流行区的白纹的幼虫,实验室饲养至成蚊,PCR扩增mtDNA-ND4基因并遗传分析。结果获mtDNA-ND4长度为324b,碱基A+T含量分别为73.2%,17个碱基置换位点,颠换率为62.5%;19个个体存在5个单倍型,单倍型多态性(h)为0.442。结论福建省不同地理株白纹伊蚊出现小程度的遗传分化,可能由遗传漂变引起的。

中国西南马mtDNA ND4基因遗传多样性研究

本研究旨在分析mtDNA ND4基因在中国西南马的遗传多样性。对中国西南马6个品种(类群)142个个体的线粒体DNA ND4基因部分序列进行PCR-SSCP和序列分析。结果表明,拼接后的西南马mtDNA ND4基因序列大小为679 bp,A+T含量(55.7%)高于G+C含量(44.3%)。共检测到11个核苷酸变异位点,这些变异位点可归纳为6种单倍型。核苷酸平均多样度为0.638%,表明受试西南马mt DNA遗传多样性并不十分丰富。对各单倍型进行聚类分析,结果提示中国西南马起源于2个母系祖先。

基于ND4和ND5基因序列研究八种臂尾轮虫的系统关系和分类地位

通过对尾突臂尾轮虫、裂足臂尾轮虫、剪形臂尾轮虫、方形臂尾轮虫、红臂尾轮虫、镰形臂尾轮虫、矩形臂尾轮虫和十指臂尾轮虫8种臂尾轮虫的ND4和ND5基因序列进行扩增、测序,结合Gen Bank数据库中的褶皱臂尾轮虫、萼花臂尾轮虫、转轮虫和旋轮虫的ND4和ND5基因序列,使用MEGA6.0软件构建这12种轮虫系统发生树(NJ树、ME树、UPGMA树),探讨了8种臂尾轮虫之间的系统关系。结果显示,本研究所涉及的轮虫ND4和ND5基因序列差异百分比均值为40.3%,可作为分子标记应用于轮虫属内种间系统关系研究;系统树所显示亲缘关系与形态学研究基本一致,均支持将十指臂尾轮虫、裂足臂尾轮虫归入臂尾轮属。

基于线粒体ND4基因的鼢鼠系统进化关系

为探讨甘肃境内鼢鼠的系统进化关系，采用PCR技术对采集的4种鼢鼠线粒体DNA ND4序列进行扩增，经序列测定后用Clustal X1．83对比，获得了17条长度为425-438bp不等的同源序列。通过DAN SP4．0比较分析，共检出160个多态信息位点，定义了15种单倍型，单倍型多样度为（Hd）：0．980±0.024。采用MEGA4．0中的NJ法、MP法构建的分子进化树表明：高原鼢鼠两群体聚在一起后再与斯氏鼢鼠聚在一起，处于较进化的位置，后与秦岭鼢鼠聚在一起形成一进化枝，再与甘肃鼢鼠群体聚在一起，甘肃鼢鼠最先分化出来，且单独成一进化枝。

基于线粒体ND4基因和核c-mos基因初步探讨广西拟水龟和艾氏拟水龟的系统发生

广西拟水龟和艾氏拟水龟的分类和系统发生多年来存在争议。通过测定广西拟水龟、艾氏拟水龟和黄喉拟水龟线粒体ND4基因和核c-mos基因部分序列,合并GenBank中拟水龟属其他物种的ND4基因和c-mos基因部分序列进行分析,从分子水平探讨广西拟水龟和艾氏拟水龟的系统发生。ND4基因数据分析发现NJ、MP和BI树中广西拟水龟与安南拟水龟的聚类分支相互交织聚为一支,二者种内遗传距离均为0.002～0.017,种间遗传距离为0.000～0.035,种间遗传距离明显小于同属内其他种间0.056～0.109的遗传距离,表明广西拟水龟与安南拟水龟可能为同一物种,可能是安南拟水龟的同种异名,或是作为安南拟水龟的一个亚种;NJ树、MP树和BI树均显示,艾氏拟水龟与黄喉拟水龟的位置和关系最为相近,二者间的遗传距离为0.020～0.035,明显小于拟水龟属其他物种间遗传距离,而明显大于同属各物种内遗传距离,艾氏拟水龟与黄喉拟水龟之间系统分类关系是介于种内与种间之间;乌龟、中华花龟、安南拟水龟等物种都是与拟水龟属中其他物种先聚成一支后再与同科的地龟属的地龟形成姐妹支,支持将乌龟属、花龟属和安南龟属并入拟水龟属的分类。c-mos基因数据分析发现,拟水龟属各物种间不存在明显的遗传距离,NJ树和MP树也未能对属中各物种的分子系统发生位置进行有效的界定,但在属及属以上阶元的分子分类系统中c-mos基因可以作为分类依据,并与线粒体基因数据有较好的一致性。

线粒体基因ND3、ND4L核苷酸变异与弱精子症相关分析

目的:对弱精子症(AST)精子线粒体DNAND3、ND4L基因突变检测和分析,探索弱精子症致病的分子机制。方法:收集弱精子症患者50例,年龄匹配的对照42例,用密度梯度离心将弱精子症患者和对照组的不同活力精子进行分离,扩增线粒体ND3、ND4L基因,测序和比对,比较弱精子症组和对照组线粒体ND3、ND4L基因核苷酸变异和单体型差异。结果:在弱精子症组和对照组中共检测出22个变异位点,其中A10157G和A10313C未见报道,G10320A、A10398G、T10609C为错义突变。A10398G和C10400T核苷酸变异率在弱精子症组显著低于对照组(P<0.05),G10310A核苷酸变异率在弱精子症组显著高于对照组(P<0.05);单体型分析可见弱精子症组单体型N百分率(33/50)显著高于对照组(14/42)(P<0.05),单体型R9在弱精子症组(15/50)的比例显著高于对照组(4/42)(P<0.05);单体型F1、F2和R9的前向运动精子百分率显著低于单体型M和Mrest(P<0.05)。对弱精子症同一病例不同活力精子进行检测,有2例不同活力的精子的线粒体单体型存在差异,活力好的精子为单体型M,而活力差的精子为单体型N;在50例弱精子症中有2例活力中等和活力差的精子标本中检测出G10310A异质性突变,而在活力好的精子标本中无G10310A突变。结论:线粒体单体型与精子活力可能存在一定的相关性;线粒体DNA10398G-10400T多态性可能是精子活力的有益因素,线粒体DNAG10310A突变可能是精子活力的有害因素。

AAV2介导ND4基因治疗LHON不同免疫抑制方案的比较研究

目的玻璃体腔注射重组ND4基因的腺相关病毒血清型2(Adenovirus associated virus 2-NADH dehydro-genase subunit 4,AAV2-ND4)是Leber遗传性视神经病变(Leber hereditary optic neuropathy,LHON)的基因治疗方法,观察基因治疗后不同免疫抑制方案组全身免疫抑制效果及ND4基因表达情况。方法各实验组(A～D组)均单次玻璃体腔注射4μL AAV2-ND4,注射后灌胃予以口服药物28d,A组不予以免疫抑制治疗,B组口服环孢霉素A[起始剂量10mg/(kg.d),14d后减半],C组口服强的松[起始剂量5mg/(kg.d),14d后减半],D组玻璃体腔同时注射曲安奈德,并口服强的松(剂量同C组),对照组(E组)单次玻璃体腔注射4μL磷酸缓冲盐溶液。分别于注射AAV2-ND4后3、7、28、56、84d后检测血清中AAV2和ND4的抗体含量,同时于第84d观察鼠视网膜上ND4的表达。结果 A～D各组抗ND4基因抗体浓度在第56天时均明显增加,以A、C组为显著;第84天时,除D组外各组抗体浓度均出现不同程度下降。A～D各组抗AAV2抗体浓度在第28天时明显增加,以A、C组为显著;第56天时除B组外各组抗体浓度均出现下降。实验各组的视网膜神经节细胞层在注射第84天仍有明显ND4表达。结论免疫反应主要集中在玻璃体腔注射AAV2-ND4后56d内;各个方案的免疫抑制效果均不理想;不同免疫抑制治疗方案对ND4的表达效率无明显影响。

心复康口服液对压力超负荷大鼠心肌ND4表达的影响

目的探讨心复康口服液对压力超负荷心衰大鼠心肌线粒体ND4 mRNA和蛋白表达的影响。方法 240只雄性SD大鼠采用随机数字表法分为3组:假手术组、腹主动脉缩窄模型组(模型组)、心复康口服液治疗组(治疗组)。采用腹主动脉部分缩窄法制作心衰大鼠模型,RT-PCR和Western blot检测分别大鼠第4、8、12周心肌线粒体ND4 mRNA和蛋白的表达。结果①术后第8周,与假手术组比较,模型组大鼠ND4 mRNA和蛋白表达均显著降低(P<0.01);与模型组比较,治疗组ND4 mRNA表达升高(P<0.01),ND4蛋白表达也升高(P<0.05)。②术后第12周,与8周时比较,模型组大鼠ND4 mRNA含量降低(P<0.05),ND4蛋白显著降低(P<0.01);与同期模型组比较,治疗组ND4 mRNA和蛋白表达均显著升高(P<0.01),较8周时也均显著升高(P<0.01)。结论心复康口服液可上调压力超负荷心衰大鼠心肌线粒体ND4 mRNA的表达,提高心肌细胞ND4蛋白含量,改善心肌能量生成障碍。

家鹅ND4基因多态性与遗传结构研究

四川白鹅、狮头鹅、豁眼鹅、伊犁鹅、朗德鹅和莱茵鹅是具有独特种质特性的家鹅品种。该试验利用直接测序法测定了具有独特种质特性,在鹅杂交育种中被广泛应用的四川白鹅等6个家鹅品种线粒体ND4基因的部分核苷酸序列(621 bp),共检测到了4种单倍型,4种单倍型的频率分别为0.467、0.033 3、0.467、0.033 3,单倍型多样性为0.582;各品种间的核苷酸分化系数(Nst)在0至1之间;6个家鹅各品种内核苷酸多样性(Pi)很低,各品种间的遗传距离(D)很小,遗传相似度高,而且同属于灰雁或鸿雁的家鹅品种之间的遗传相似度比分属于灰雁、鸿雁的家鹅品种之间的遗传相似度更高。另外,对这6个家鹅品种的遗传结构形成原因和杂交利用进行了初步分析。

基于线粒体ND4基因探讨水龟组系统发生关系(英文)

水龟组由旧大陆潮龟科的拟水龟属、眼斑龟属和新大陆龟科的水龟属组成,这三个属以前一直被认为是同属的,但没有得到形态学和染色体等方面的认同.本文测定了四眼斑水龟和黄喉拟水龟线粒体基因组的ND4基因,用部分ND4基因及相邻tRNA基因共985bp的序列(包含简约信息位点235bp)讨论了它们的系统进化关系.MP树和ML树显示:在水龟属中,牟氏水龟和木雕水龟亲缘关系最近,与星点水龟亲缘关系次之,石纹水龟位于水龟属的基部,与水龟属其它物种的亲缘关系较远.拟水龟属与眼斑龟属在潮龟科是姐妹群关系,但与龟科水电属亲缘关系较远.本文结果支持潮龟科和龟科的单系起源,二者为非姐妹群.

巨魾线粒体ND3,tRNA-Arg和ND4L基因克隆及多态性分析

为了解巨魾鱼的种质资源情况,采用PCR技术扩增克隆并测序,得到巨魾NADH dehydrogenase subunit-3(ND3),精氨酸的转运RNA(tRNA-Arg)和NADH dehydrogenase subunit-4L(ND4L)基因全序列各12条.通过DNAMAN 5.2.2软件进行序列比对,采用MEGA 5.02软件进行碱基质量分数分析,计算遗传距离,并构建系统发育树.结果表明:巨魾鱼ND3基因序列全长为346bp,碱基质量分数A为26.2%,T为29.6%,C为28.8%,G为15.4%,其中A+T质量分数(55.8%)高于G+C质量分数(44.2%),12个ND3基因序列存在5种单倍型,发生了5次转换,1次颠换,5种单倍型之间平均相对遗传距离为0.007;tRNA-Arg基因序列全长为71bp,碱基质量分数A为23.9%,T为23.9%,C为29.6%,G为22.6%,其中A+T质量分数(47.8%)低于G+C质量分数(52.2%),12个基因序列完全一致;ND4L基因序列全长为297bp,起始密码子为ATG,终止密码子为TAA,碱基质量分数A为24.6%,T为26.3%,C为33.3%,G为15.8%,其中A+T质量分数(50.9%)高于G+C质量分数(49.1%),12个基因序列完全一致;将巨魾鱼与鮡科的其他10种鱼类的ND3,tRNA-Arg和ND4 L基因用Minimum Evolution法(ME)构建系统发育树,发现12尾巨魾鱼单独聚为一支,这一结果与传统的形态学分类相似.

论著线粒体DNAND4基因12026(A→G)点突变与2型糖尿病相关性研究

目的研究中国云南2型糖尿病人群线粒体ND4基因nt12026A→G点突变的发生频率及其与2型糖尿病的相关性.寻求准确、快速、简易的临床糖尿病基因诊断方法.方法随机选取350例中国云南2型糖尿病患者和225例无糖尿病家族史的健康对照者作为研究对象.通过聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)检测线粒体12026A→G点突变.结果经DNA直接测序确证.结果350例2型糖尿病患者中12026A→G点突变者11例(3.14%),225例对照者中携带该突变者6例(2.67%),突变发生率在两组间差异无统计学意义(χ2=0.0059,P=0.8064).结论线粒体ND4基因12026A→G突变可能仅为人群中线粒体基因组的正常多态,不是中国(特别是云南)人群中2型糖尿病的常见致病因.

核苷类似物对小鼠肝细胞线粒体DNA ND1和ND4的影响

目的探讨长期使用核苷类似物(NAs)是否导致小鼠肝脏线粒体DNA(mt DNA)ND1和ND4区损伤。方法 7周龄雌性Balb/c小鼠25只,采用简单随机分组法分为5组,对照组和4种核苷类似物组,每组各5只。实验组司他夫定(D4T)50 mg/kg,齐多夫定(AZT)100 mg/kg,拉米夫定(3TC)50 mg/kg和去羟肌苷(DDI)50 mg/kg,对照组为双蒸水,分别腹腔内注射,每周5次,连续3个月。留取各组肝组织,应用激光捕获显微技术获取肝细胞,对mt DNA ND1和ND4区克隆和测序。结果其余各组肝细胞的mt DNA ND4序列距离与参考序列的平均距离与对照组比较,差异均有高度统计学意义(P<0.01);AZT组肝细胞的mt DNA ND4平均d N与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);肝细胞mt DNA ND1的序列距离与参考序列的平均距离,AZT组和3TC组序列距离与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01);DDI组肝组织mt DNA ND1的平均d S与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);AZT组和3TC组肝细胞mt DNA ND1的平均d S与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论长期暴露于NAs可导致小鼠肝细胞mt DNA ND1和ND4区病变。

长蠹科几种检疫性害虫的ND4基因序列及系统进化

长蠹科昆虫严重危害林木和仓贮物品。应用非损伤性DNA测序技术测定了来自不同国家的长蠹科害虫的线粒体DNAND4基因的部分序列。在获得的 2 0 4bp的序列中 ,5种昆虫的序列变异丰富 ,多数变异发生在密码子的第 3位点上。用PAUP3 1 1数据分析软件构建了 5个种的合意简约树。并将实验结果与形态学特征比较分析 ,探讨 5个种及所在属的系统进化。结果表明 :双钩异翅长蠹所在的异翅长蠹属分化最早 ,其次是竹大长蠹所在的大长蠹属、双棘长蠹和黑双棘长蠹所在的双棘长蠹属及红艳长蠹所在的钻木长蠹属。双棘长蠹和黑双棘长蠹隶属同一个属 ,遗传关系最近 ,分化最晚 ,与形态学研究结果相吻合。

基于线粒体ND4基因序列的七种条纹光唇鱼系统发育及对半刺光唇鱼分类地位的质疑

光唇鱼属（Acrossocheilus）隶属于鲤形目（Cyprini-formes）鲤科（Cyprinidae）鲃亚科（Barbinae Oshima,1919）,广泛分布于东南亚和东亚,其中包括中国南部（包含台湾和海南岛）、越南和老挝。伍献文等[1]于1977年鉴定了本属的19个种或亚种,

以ND4L和ND4基因为标记探讨黑腹果蝇种组的系统发育关系(英文)

多年来的形态学、染色体组学以及DNA序列几个方面的研究均没有很好地阐明黑腹果蝇种组内的系统发育关系。本实验测定了33个样品的ND4和31个样品的ND4L基因序列,以D.obscuroides为外群,用最大简约法和Bayesian法分别构建进化树。结果表明两种方法构建的拓扑结构一致,而且大部分支系的支持率较高。整个黑腹果蝇种组分成三大谱系:1)montium种亚组;2)ananassae种亚组;3)Oriental种亚组(melanogaster、ficsphila、eugracilis、elegans、suzukii、takahashii),montium是最早分化的种亚组。在第三谱系中,melanogaster分化得最早;然后依次是ficsphila,eugracilis,elegans;suzukii与takahashii为姐妹种亚组,最后分化。