NEP1-40基因克隆及蛋白的原核表达和纯化

目的通过基因工程手段从大鼠脊髓中获取Nogo-66、NEP1-40基因并实现其蛋白的体外表达。方法从幼年大鼠的脊髓组织中,通过RT-PCR技术获得Nogo-66、NEP1-40基因,将目的基因通过基因连接反应与T载体连接,重组质粒进行基因序列测序,构建PQE30-GST和目的基因的高表达质粒,异丙基-β-D-硫代半乳糖(isopropy-lthiogalactoside,IPTG)诱导表达,Ni柱纯化,Western-blot法检测纯化的目的蛋白。结果成功获得大鼠Nogo-66、NEP1-40基因,加上两端的酶切位点和保护性碱基,大小分别为215bp和137bp。序列测序显示基因突变率为0,表达质粒构建双酶切(BamH和Hind)可见目的基因的条带,经IPTG诱导表达,获得带GST标签的融合蛋白Nogo-66和NEP1-40,相对分子质量分别为33.2×103和30.3×103。蛋白纯化结果理想,经Western-blot分析证实抗原性正确。结论Nogo-66、NEP1-40蛋白可通过基因工程手段获得体外高效表达,这将对其功能的研究及脊髓损伤疫苗的研究提供基础。

NEP1-40对成年单眼剥夺弱视大鼠视皮层可塑性的再激活作用

目的:探讨NEP1-40对成年单眼剥夺弱视大鼠视皮层结构及功能可塑性的再激活作用及意义。方法:60只新生SD大鼠随机分为6组:正常对照组(Nor)、正常+PBS治疗组(Nor+PBS)、正常+NEP1-40治疗组(Nor+NEP)、模型对照组(MD)、模型+PBS治疗组(MD+PBS)及模型+NEP1-40治疗组(MD+NEP)。模型组大鼠于出生后21d缝合右侧眼睑建立单眼剥夺弱视模型,于45日龄时打开剥夺眼,对各组大鼠行闪光视觉诱发电位(F-VEP)检测,确定单眼剥夺模型建立成功后,对需给药的各组大鼠按组别给予NEP1-40或PBS侧脑室注药治疗7d。于52日龄时对各组大鼠再次行F-VEP检测后处死动物,取左侧视皮层进行透射电镜观察突触超微结构变化。结果:45日龄时F-VEP检测示,MD组、MD+PBS组及MD+NEP组与Nor组比较,P波潜伏期延长,波幅降低(P<0.05);52日龄时F-VEP检测示,MD+NEP组与MD组、MD+PBS组大鼠比较,右眼F-VEP的P波潜伏期及波幅差异有统计学意义(P<0.05),而与Nor组比较差异无统计学意义(P>0.05);MD+PBS组与MD组大鼠比较,右眼F-VEP的P波潜伏期及波幅差异无统计学意义(P>0.05),而与Nor组比较差异有统计学意义(P<0.05)。透射电镜观察视皮层神经元突触界面结构参数:与Nor组比较,MD组大鼠剥夺眼对侧视皮层神经元突触间隙增大,突触活性区长度缩短,突触界面曲率减小,突触后致密物厚度变薄(P<0.05)。MD+NEP组大鼠剥夺眼对侧视皮层神经元突触界面结构参数的各项指标均较MD组、MD+PBS组明显改善(P<0.05),与Nor组相比除突触间隙外(P<0.05),其余各项参数差异无统计学意义(P>0.05)。MD+PBS组与MD组大鼠比较剥夺眼对侧视皮层神经元突触界面结构参数的各项指标差异均无统计学意义(P>0.05),而与Nor组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:NEP1-40可使成年单眼剥夺弱视大鼠剥夺眼对侧视皮层神经元的突触界面结构参数得以恢复,F-VEP的P波潜伏期及波幅恢复至正常水平,重新"激活"被抑制的视皮层结构及功能可塑性,为成年弱视患者提供新的治疗途径奠定了理论基础。

NEP1-40促进高苯丙氨酸损伤大鼠神经元Nogo A表达

目的了解神经元NgR受体拮抗剂NEP1-40对高苯丙氨酸（Phe）作用下大鼠大脑皮质层神经元Nogo A蛋白表达的影响。方法原代培养胎龄16~18 d的SD大鼠皮质神经元,体外模拟高Phe（0.9 mmol/L）环境,并用不同浓度NEP1-40干预;用免疫荧光方法检测神经元轴突生长和生长锥塌陷情况,实时荧光定量PCR和Western blot检测Nogo AmRNA和蛋白表达。结果 Nogo A可以在神经元胞体和突起表达;高Phe作用12、24和48 h神经元NogoAmRNA与α微管蛋白（α-Tub）的相对表达量明显减低（P〈0.05）;高Phe作用后神经元Nogo A蛋白明显降低（P〈0.05）;NEP1-40对正常神经元无促进作用,但对高phe作用下的神经元呈浓度依赖性地促进其Nogo A的表达。结论 NEP1-40可以促进高Phe损伤时神经元Nogo A的表达增高,从而促进神经元轴突的生长。

NEP1-40对缺氧缺血性脑病新生大鼠的Wnt信号通路胞增殖的调控作用

目的探讨Nogo-A受体拮抗剂NEP1-40对Wnt信号通路和神经细胞增殖的调控作用。方法 40只大鼠被均分为HIBD(缺氧缺血性脑损伤)组和HIBD+NEP1-40组,采用PCR定量、Western blot分析、细胞增殖的免疫组化试验、8-异前列腺素评估等检测分析缺氧缺血性脑病新生大鼠的修复过程中Wnt信号通路中NgR的转录因子调控与神经细胞增殖。结果NEP1-40处理后,c Jun和c-Myc的表达在蛋白水平上调,基因表达水平上调,Ki-67增加,8-异前列腺素无显著变化。结论通过抑制NgR后发现,c-Jun和c-Myc是Wnt通路的主要转录因子,同时脑室下区神经细胞的增殖增加。

TAT-NEP1-40融合蛋白的表达、纯化及蛋白转导功能的鉴定

为大量获得高纯度具有蛋白转导功能并可以穿过血脑屏障的融合蛋白TAT-NEP1-40,将构建好的表达载体pTAT-NEP1-40转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达后。将融合蛋白进行纯化和复性,鉴定蛋白转导功能。带有重组质粒pTAT-NEP40的大肠杆菌经IPTG诱导后,主要以包涵体形式表达,融合蛋白的分子量大小为14kD,其表达量占菌体总蛋白量的31.59%,纯化后目的蛋白纯度达95.6%,通过免疫组化染色显示融合蛋白可以穿过血脑屏障进入脑组织。上述结果表明利用pTAT-NEP1-40重组质粒,可以成功地表达TAT-NEP1-40;纯化后该蛋白具有穿过血脑屏障的功能,为NEP1-40功能的进一步研究提供了基础。

慢病毒载体介导的NEP1-40在人脐血间充质干细胞中的表达

背景:近年来研究证明间充质干细胞具有高度增殖和多向分化潜能,是一种理想的组织工程种子细胞,能高效转染表达外源性目的基因,在基因治疗领域具有广阔的应用前景。目的:将含有NEP1-40基因的慢病毒载体转染脐血间充质干细胞,评价基因转染后脐血间充质干细胞生物学功能变化,观察NEP1-40在脐血间充质干细胞中的表达。方法:体外分离和培养人脐血间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记,并对其生物学特性进行鉴定。同时将NEP1-40基因克隆入慢病毒载体,包装出病毒上清,以不同拷贝数转染脐血间充质干细胞。结果与结论:实验通过密度梯度离心法成功在体外分离和培养脐血间充质干细胞,诱导其向脂肪细胞分化,流式细胞仪检测结果显示脐血间充质干细胞中CD90、CD73及CD105蛋白阳性,不表达CD14、CD34、CD45、CD19、HLA-DR、Stro-1及CD106蛋白;real-timePCR检测发现其NEP1-40mRNA表达水平与转染拷贝数有关,转染拷贝数越高,NEP1-40的表达量越高,此外转染NEP1-40后的脐血间充质干细胞中可检测到NEP1-40蛋白,提示NEP1-40基因转染后脐血间充质干细胞原有的生物学功能无明显影响。

NEP1-40对视网膜缺血-再灌注损伤过程中视网膜细胞的保护作用

背景 视网膜缺血-再灌注损伤（RIRI）可导致细胞凋亡,凋亡是一个复杂的过程,与许多基因有关,探讨药物对RIRI后视细胞凋亡的保护作用具有重要意义. 目的 探讨Nogo-A在大鼠RIRI模型中的表达及其与细胞凋亡的关系,研究Nogo受体竞争性拮抗剂NEP1-40对视网膜细胞的保护作用. 方法 将78只SD大鼠按随机数字表法随机分为正常组、RIRI组和NEP1-40组,RIRI组及NEP1-40组大鼠分别用前房升高眼压的方法升高眼压至大鼠视网膜苍白,持续60 min,然后恢复眼压至视网膜色泽恢复,制作RIRI大鼠模型.术后6h、12 h及1、2、3、7d用过量的水合氯醛处死大鼠,制备视网膜标本.透射电子显微镜下观察各时间点各组大鼠视网膜的超微结构,采用TUNEL法检测视网膜细胞的凋亡情况,并计算细胞凋亡指数（AI）.采用免疫组织化学法检测视网膜组织中Nogo-A蛋白的表达,并采用逆转录PCR（RT-PCR）法半定量检测Nogo-A mRNA在视网膜中的表达. 结果 正常组大鼠视网膜各层结构正常；RIRI组大鼠视网膜再灌注12h后可见少量视网膜细胞器的线粒体嵴异常及空泡化,再灌注后1 ～2d可见凋亡小体；NEP1-40组视网膜的视细胞外节膜盘略疏松,部分线粒体嵴短小,空泡化,未见凋亡小体,视网膜细胞超微结构损害明显轻于RIRI组.TUNEL检测显示细胞凋亡出现于再灌注后6h,并逐渐递增,再灌注后1d凋亡细胞数目达高峰,2d后开始下降,但再灌注后3d仍可见TUNEL阳性细胞.NEP1-40组各时间点间凋亡细胞数目较RIRI组明显减少.正常组、RIRI组和NEP1-40组大鼠在不同时间点细胞AI的差异均有统计学意义（F分组=100.850,P=0.000;F时间=34.309,P=0.000）,其中RIRI组和NEP1-40组大鼠视网膜细胞AI明显高于正常组,而NEP1-40组AI明显低于RIRI组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）.Nogo-A蛋白及其mRNA主要表达于RIRI后的视网膜,再灌注后6h大鼠视网膜中Nogo-A蛋白及其mRNA均开始增加,至再灌注id时表达达高峰,然后逐渐减弱,但再灌注后7d仍有表达.3个组大鼠不同时间点视网膜中Nogo-A蛋白的表达差异有统计学意义（F分组=164.139,P=0.000; F时间=21.772,P=0.000）,Nogo-A mRNA的表达差异有统计学意义（F分组=93.889,P=0.000;F时间=6.349,P=0.000）,NEP 1-40组和RIRI组大鼠视网膜中Nogo-A蛋白及其mRNA的表达均明显高于正常组,而NEP1-40组大鼠视网膜中Nogo-A蛋白及其mRNA在各时间点的表达均低于RIRI组,差异均有统计学意义（P＜0.05）. 结论 Nogo-A可促进RIRI后视网膜细胞的凋亡,NEP1-40能抑制Nogo-A的表达,从而减少视网膜细胞的凋亡,对RIRI后的视网膜细胞有保护作用.

NEP1-40治疗增加大鼠脊髓损伤引起的降钙素基因相关肽CGRP的表达

目的探讨大鼠脊髓损伤(spinal cord impairment,SCI)后Nogo受体拮抗剂NEP1-40对降钙素基因相关肽(calcitoningene related peptide,CGRP)表达的影响。方法取雌性SD大鼠,随机分成对照组、生理盐水组和NEP1-40治疗组,每组60只。生理盐水组和NEP1-40治疗组的大鼠建立脊髓半切损伤模型,并在蛛网膜下腔留管,再分别注射生理盐水和NEP1-40;对照组的大鼠不损伤脊髓。SCI后1、3、7、14、21 d收集损伤部位的脊髓组织,再用免疫荧光、免疫印迹检测每组CGRP蛋白含量,并在术后7 d采用免疫荧光双标技术检测损伤部位的脊髓内生长相关蛋白-43(growth associated protein 43,GAP-43)、CGRP的表达量。结果生理盐水组CGRP阳性神经细胞减少,而NEP1-40组CGRP阳性神经细胞24 h内减少,然后开始增多,到术后7 d达到高峰,之后一直维持在高水平表达,而对照组发现CGRP阳性神经细胞在低水平表达。免疫印迹和免疫荧光的结果一致。术后7 d,NEP1-40组GAP-43阳性神经细胞数最多,生理盐水组次之,对照组未发现,而且发现GAP-43和CGRP有共表达。结论脊髓损伤后,NEP1-40可以降低神经细胞Nogo-A的表达而大量增加CGRP、GAP-43的表达,从而改善脊髓的内环境,促进神经突起的修复。

慢病毒介导NEP1-40转染神经干细胞的研究

目的通过慢病毒载体将NEP1-40基因转入神经干细胞内表达,探讨NEP1-40基因体外转染大鼠神经干细胞的可行性。方法将大鼠胚胎室管膜区神经干细胞(NSC)采用已成功构建的NEP1-40慢病毒载体转染,同时设立空白慢病毒载体对照组及神经干细胞对照组。用荧光显微镜观察细胞内荧光表达情况,计算转染率,采用RT-PCR及Western blot法检测NEP1-40在细胞内表达情况。结果 NEP1-40基因慢病毒载体转染NSC其感染复数(MOI)为10时,最佳转染率可达96%;转染后NSC中GFP荧光表达24h开始出现,48h达最高分值,并且可以稳定表达。RT-q PCR提示NEP1-40mRNA表达在实验组明显增加,Western blot结果提示NEP1-40及GFP融合蛋白在细胞内稳定表达。结论经慢病毒携带NEP1-40基因成功转染入NSC内,并且可在NSC内稳定表达。

NEP1-40和甲基强的松龙联合治疗对脊髓修复的影响

目的:探讨甲基强的松龙(MP)和NEP1-40联合治疗对大鼠脊髓损伤后脊髓的功能恢复的影响。方法:选用SD大鼠60只,随机分为联合治疗组、MP治疗组、NEP1-40治疗组和对照组4组。建立大鼠中段胸部脊髓后半部横切模型。MP的给药方法为术后30 min内经鼠尾静脉给予MP 30 mg/kg,后给予剂量5.4 mg/(kg.h),持续23 h;NEP1-40的给药方法为术后3 d于硬膜下管给予NEP1-40 12.5μg/(20μl PBS.d),连续7 d。对照组给予等量生理盐水。不同时间点进行运动诱发电位(MEP)测定和行为学评价。结果:联合治疗组大鼠潜伏期延迟时间较MP、NEP1-40治疗组和对照组短,5 w时接近正常,其P1波的潜伏时间为5.42 ms,N1波的潜伏时间为5.55 ms(P<0.01),其BBB运动评分5 w时为17分(P<0.01);联合治疗组的空洞面积百分比不到对照组的一半(P<0.01);NF200阳性染色的神经元数目为20.19个/1000μm2。结论:MP和NEP1-40联合治疗可减少病变范围,减轻白质纤维脱髓鞘病变,增多NF200阳性神经元数目,促进神经再生,改善由于脊髓后半横切所引发的脊髓电生理的障碍,促进了脊髓功能恢复。在治疗脊髓损伤时,MP与NEP1-40有协同作用,促进脊髓功能恢复。

脑缺血再灌注大鼠GAP-43和RhoA蛋白表达及NEP1-40对其的影响

目的观察侧脑室注射NEP1-40对脑缺血再灌注大鼠轴突再生、患肢功能恢复和RhoA信号通路活动的影响,探讨其可能的机制。方法将60只成年雄性SD大鼠分为假手术组、脑缺血对照组、侧脑室注射PBS组和侧脑室注射NEP1-40组;采用线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型;用Western blot方法检测缺血灶周边脑组织生长相关蛋白(GAP-43)和RhoA蛋白表达;用Montoya设计的"楼梯测试"方法对患肢运动功能进行测试。结果①侧脑室注射NEP1-40组大鼠缺血灶周边脑组织GAP-43在术后7d和14d均高于脑缺血对照组和侧脑室注射PBS组,以术后7d最显著。②侧脑室注射NEP1-40组大鼠缺血灶周边脑组织RhoA在术后各时相点显著低于脑缺血对照组和侧脑室注射PBS组。③侧脑室注射NEP1-40组大鼠在术后各时相点"楼梯测试"结果显著高于脑缺血对照组和侧脑室注射PBS组。结论NEP1-40能够促进脑缺血再灌注大鼠损伤后轴突再生和运动功能恢复,其机制可能与抑制RhoA信号通路活动有关。

共表达NEP1-40和PRP-1多顺反子重组scAAV的构建

目的:构建共表达NEP1-40和PRP-1多顺反子重组双链腺相关病毒(scAAV)。方法:PCR扩增NEP1-40、PRP-1及FMDV2A的cDNA,建立NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1嵌合肽cDNA。两端加入Flag肽和6×His肽后合成融合基因cDNA,克隆到PES载体构建出重组质粒PES/NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1。双酶切重组质粒PBV220-NT4-NAP和PES/NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1,连接得到重组质粒pBV220-NT4/NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1。以腺相关病毒pSS-CMV构建双链腺相关病毒穿梭质粒ssAAV pSSHG-NT4/NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1。经细胞内同源重组得到共表达NEP1-40和PRP-1的重组双链腺相关病毒scAAV pSSHG-NT4/NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1。测定病毒滴度并利用鸡胚背根神经节检测其生物活性。结果:克隆了共表达NEP1-40和PRP-1的多顺反子融合基因cDNA,基因测序及核苷酸序列同源性比较结果与设计序列一致;构建了重组质粒pBV220-NT4/NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1,酶切鉴定、核酸序列测定结果与理论值一致;重组的双链腺相关病毒scAAV pSSHG-NT4/NEP1-40-FMDV 2APRP-1应用于鸡胚背根神经节显示明显促进神经突起生长。结论:成功构建了共表达NEP1-40和PRP-1的重组双链腺相关病毒scAAV pSSHG-NT4/NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1,并显示出促进鸡胚背根神经节神经突起生长作用。

Anti-NEP1-40多克隆抗体的制备与检测

目的制备Anti-NEP1-40多克隆抗体。方法合成NEP1-40多肽,采用弗氏佐剂制备免疫抗原,多次多点皮下注射健康雄性家兔,刺激机体产生相应抗体,颈动脉放血分离兔血清。结果获得含NEP1-40抗体的免疫血清,其抗体特异性好,亲和力较高。结论 NEP1-40兔多克隆抗体可以满足NEP1-40相关的科学研究。

NEP1-40基因修饰对神经干细胞移植后存活和分化的影响

目的探讨NEP1-40(Nogo extracellular peptide residues 1-40)基因修饰对神经干细胞(neural stem cells,NSCs)移植后存活和分化的影响。方法从孕18 d Wistar大鼠胚胎大脑皮质中分离获得原代NSCs并进行体外培养。采用慢病毒载体将NEP1-40基因导入第3代NSCs内完成NEP1-40基因修饰。将30只成年雌性SD大鼠在T9水平进行脊髓右侧半切后随机分为脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)组(B组)、NSCs移植组(C组)、NEP1-40基因修饰NSCs组(D组),每组各10只,伤后7 d在损伤局部分别植入NSCs基础培养基、NSCs悬液及NEP1-40基因修饰的NSCs;另取10只SD大鼠仅行T9椎板切除设为假手术组(A组)。移植后8周,取损伤段脊髓组织行辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)神经示踪、巢蛋白(Nestin)免疫荧光染色及神经丝蛋白200(neurofilament 200,NF-200)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic portein,GFAP)、髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)免疫组织化学染色,评价神经纤维再生情况及移植细胞存活和分化情况。结果移植后8周,A、B、C、D组HRP阳性染色神经纤维束分别为(85.17±6.97)、(12.17±2.79)、(33.58±5.47)、(59.25±7.75)个,B、C、D组显著少于A组(P<0.01);但C、D组显著高于B组,D组显著高于C组,差异均有统计学意义(P<0.01)。Nestin免疫荧光染色示,A组未见明显Nestin荧光信号,B组仅可见少量散在荧光信号,C、D组有较强荧光信号。免疫组织化学染色定量分析示,NF-200阳性细胞数及MBP积分吸光度(IA)值A组最高,D组次之,C组较少,B组最少,组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05);GFAP阳性细胞数B组最多,D组次之,C组较少,A组最少,组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05);C、D组间NF-200、GFAP、MBP阳性细胞百分比比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 NEP1-40基因修饰对NSCs移植后的分化无明显诱导性,但能促进移植细胞存活、分化及神经元轴突再生,为研究NSCs移植治疗SCI提供了新思路。

NEP1-40基因修饰的神经干细胞移植对脊髓损伤大鼠行为学恢复的影响

目的通过与单纯的神经干细胞移植进行比较,探讨NEP1-40基因修饰的神经干细胞移植对脊髓损伤大鼠行为学恢复的影响。方法从孕18 d的Sprague-Dawley（SD）大鼠胚胎大脑皮质中分离获得原代神经干细胞,体外培养及传代后采用巢蛋白免疫荧光染色进行鉴定。采用已成功构建的慢病毒载体将NEP1-40基因导入第3代神经干细胞内建立NEP1-40基因修饰的神经干细胞。将30只SD大鼠在第9胸椎水平进行脊髓右侧半切后随机分为3组,每组各10只,伤后第7天在损伤局部分别植入细胞培养液（损伤组）、神经干细胞（NSC组）及NEP1-40基因修饰的神经干细胞（NEP1-40-NSC组）。另取10只仅行第8~10胸椎椎板切除,设置为假手术组。细胞移植前和移植后8周通过Basso-Beattle-Bresnahan（BBB）运动功能评分及网格测试评价神经功能恢复情况。结果细胞移植后8周,BBB测试及网格测试结果显示：损伤组大鼠BBB评分最低且网格摔倒次数最多,单纯神经干细胞移植组BBB评分较之增高且网格摔倒次数减少（P〈0.01）,而NEP1-40基因修饰的神经干细胞移植组BBB评分最高且网格摔倒次数最少,和前两组相比差异均有统计学意义（P〈0.01）。结论 NEP1-40基因修饰能进一步提高单纯神经干细胞移植对于大鼠脊髓损伤后行为功能恢复的治疗效果,为研究神经干细胞移植治疗脊髓损伤提供了新的思路和实验依据。

慢病毒介导NEP1-40及NT-3双基因转染神经干细胞的实验研究

目的通过慢病毒载体将NEP1-40(Nogo extracellular peptide residues 1-40)及神经营养因子_3(neurotrophin 3,NT-3)双基因转染入神经干细胞(neural stem cells,NSC_s)内进行表达,探讨NEP1-40及NT-3双基因转染NSC_s的可行性,为NSC_s体内实验奠定基础。方法将SD大鼠胚胎室管膜区NSC_s采用空载慢病毒载体(A组)、NEP1-40慢病毒载体(B组)、NT-3慢病毒载体(C组)及NEP1-40和NT-3慢病毒载体(D组)进行转染,以未转染病毒的细胞作为对照组(E组)。用感染复数(multiplicity of infection,MOI)为5、10、15的慢病毒载体分别转染24、48、72 h,荧光显微镜观察转染后细胞内荧光表达情况,确定慢病毒载体的最佳MOI和收样时间。再分别通过实时荧光定量PCR及Western blot,检测转染后细胞中NEP1-40及NT-3基因的表达,以及细胞和培养基中NEP1-40及NT-3蛋白的表达。结果荧光显微镜观察示,MOI为10时NEP1-40和NT-3基因慢病毒载体在NSC_s内转染率最高,最佳时间为转染48 h时。实时荧光定量PCR及Western blot检测示,B、D组NEP1-40 m RNA相对表达量和蛋白相对表达量均显著高于A、C组,差异有统计学意义(P<0.05);A、C组间及B、D组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。C、D组NT-3 m RNA相对表达量和蛋白相对表达量均显著高于A、B组,差异有统计学意义(P<0.05);A、B组间和C、D组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论通过慢病毒载体可将NEP1-40及NT-3双基因成功转染入NSC_s内,在NSC_s内稳定表达,且两种目的基因在表达过程中无相互拮抗或促进作用。

NEP1-40基因慢病毒载体构建及鉴定

目的构建NEP1-40(Nogo extra cellular peptide residues 1-40)基因慢病毒表达载体,为后续转染目的细胞奠定基础,并实现在细胞中高效、稳定表达。方法从含有NEP1-40基因的cDNA文库中,利用PCR方法钓取NEP1-40基因编码区片段。将目的基因与酶切线性化的载体pGC-FU进行定向连接,其产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆先进行菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,比对正确的克隆即为构建成功的目的质粒。将构建成功的目的质粒和两种辅助包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒,荧光显微镜下观察慢病毒转染293T细胞后荧光表达情况,采用Western blot检测NEP1-40及绿色荧光蛋白融合蛋白表达情况。结果 PCR产物经电泳分析表明成功获取NEP1-40基因cDNA克隆,测序提示慢病毒转染质粒连接构建正确;荧光表达检测显示293T细胞中产生慢病毒颗粒;Western blot显示NEP1-40在细胞内稳定表达。结论成功构建NEP140基因慢病毒表达载体,为后续转染目的细胞后从分子水平探讨NEP1-40基因功能奠定了实验基础。

载A3NEP1-40脊髓组织工程支架材料控释规律的研究

目的探讨A3NEP1-40以RADA-IKVAV／FRM为载体的缓释规律。方法DMEM／F12溶液能触发RADA-IKVAV／FRM自组装，包裹A3NEP1-40形成均质水凝胶。将包裹125μg及25μg A3NEPl40的水凝胶各自放入2．5ml及0．5ml磷酸盐缓冲液（PBS）中进行释放，并依此分为A、B、C．D4组。应用高效液相色谱仪检测并计算A3NEP1-40每天释放量及累计释放量，统计学分析释放规律。结果（1）最初的24h呈爆发释放，40％的A3NEPl-40自凝胶内释出；平稳释放阶段内样本中可持续检测到A3NEP1-40释放达40d。（2）A组与B组、C组与D组差异无统计学意义，A组与C、D两组、B组与C、D两组差异有统计学意义（P〈0．05）。结论RADA-IKVAV／FRM可以控制A3NEP1-40释放速度，达到缓释效果，是一种较为理想的神经组织工程材料，同时也可以用作载体构建缓释药物。

TAT-NEP1-40——神经再生的新型药物

在受损的中枢神经系统中,Nogo-A蛋白、髓鞘蛋白和少突髓鞘蛋白是抑制中枢神经轴突再生的主要物质,它们通过一个共同受体——Nogo蛋白受体(Nogo receptor,NgR)介导中枢神经轴突抑制。NEP1-40是NgR受体的竞争性抑制剂,是治疗中枢神经损伤是一个具有潜在性的候选药物。TAT蛋白质转导序列是HIV反式转录激活因子,是目前已知具有有效蛋白质转导功能的序列。利用蛋白质重组技术构建并表达的含有TAT结构域和NEP1-40肽的融合蛋白质TAT-NEP1-40可能成为一种治疗中枢神经系统损伤如中风、脑缺氧、脑出血、脑外伤和脊髓损伤的新颖的候选药物。

融合蛋白TAT-NEP1-40对PC12细胞氧糖剥脱模型保护作用的研究

目的观察融合蛋白TAT-NEP1-40的细胞转导功能及其对PC12细胞氧糖剥脱模型(OGD)损伤的保护作用。方法含80nmol/L浓度TAT-NEP1-40的DMEM培养液孵育PC12细胞60min后,用免疫荧光染色法检测该融合蛋白的细胞转导功能;以Na2S2O4造成缺氧合并缺糖模拟PC12细胞缺血性损伤,分别给予TAT-NEP1-40、TAT-β-gal及β-gal等进行处理,利用MTT比色法、FCM法及Hoechst33258染色法检测PC12细胞存活情况并计算保护率,观察TAT-NEP1-40对模拟PC12细胞缺血性损伤的保护作用。结果 (1)TAT-NEP1-40蛋白能跨细胞膜进入PC12细胞;(2)该蛋白具有保护作用,最大保护率为66.8%;(3)该蛋白能提高PC12细胞拟缺血损伤时的存活率,TAT-NEP1-40较OGD模型组高,活细胞生存率分别为(90.05±1.83)%、(77.10±2.00)%,P<0.05。结论融合蛋白TAT-NEP1-40具有细胞转导功能,对体外模拟PC12细胞缺血性损伤具有保护作用。