一链双靶siRNA对皮肤鳞状细胞癌NET-1和Survivin基因表达及增殖和凋亡的影响研究

目的:探讨一链双靶siRNA对人皮肤鳞癌细胞株(A431)NET-1和Survivin基因的抑制作用以及对细胞增殖、凋亡的影响。方法:构建siRNA NET-1、siRNA Survivin以及同时靶向NET-1和Survivin基因的一链双靶siRNA。采用免疫共沉淀法检测NET-1和Survivin蛋白在A431人皮肤鳞癌细胞中的相互作用。将A431细胞分为siRNA-NET-1组、siRNA-Survivin组、siRNA-NET-1&Survivin组、siRNA-NC组和control组,分别进行细胞转染。qRT-PCR和Western Blot法分别检测细胞内NET-1、Survivin mRNA和蛋白表达,细胞免疫荧光法观察NET-1、Survivin蛋白在细胞内的表达及定位。CCK-8法和流式细胞仪分别检测细胞增殖与凋亡情况。结果:免疫共沉淀法证实NET-1和Survivin蛋白有相互作用。qRT-PCR和Western Blot结果显示,siRNA-NET-1&Survivin组、siRNA-NET-1组和siRNA-Survivin组细胞中NET-1和Survivin mRNA和蛋白表达水平均低于siRNA-NC组及control组,siRNA-NET-1&Survivin组低于siRNA-NET-1组和siRNA-Survivin组,差异均有统计学意义(P<0.05)。CCK-8法检测显示,siRNA-NET-1&Survivin组、siRNA-NET-1组和siRNA-Survivin组细胞增殖水平低于siRNA-NC组和control组,siRNA-NET-1&Survivin组低于siRNA-NET-1组和siRNA-Survivin组,差异均有统计学意义(P<0.05)。流式细胞仪检测显示,siRNA-NET-1&Survivin组、siRNA-NET-1组和siRNA-Survivin组细胞凋亡率高于siRNA-NC组和control组,siRNA-NET-1&Survivin组高于siRNA-NET-1组和siRNA-Survivin组,差异均有统计学意义(P<0.05)。细胞免疫荧光显示,siRNA-NET-1&Survivin组、siRNA-NET-1组和siRNA-Survivin组NET-1和Survivin蛋白表达阳性细胞百分率低于control组,siRNA-NET-1&Survivin组低于siRNA-NET-1和siRNA-Survivin组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:NET-1和Survivin蛋白存在相互作用,靶向NET-1和Survivin的一链双靶siRNA能同时下调A431细胞NET-1和Survivin基因表达,并能抑制A431细胞增殖,促进细胞凋亡,一链双靶siRNA作用效果优于单靶siRNA。

肝癌及相关组织中NET-1基因与蛋白的表达

背景与目的:NET-1是最近发现的肿瘤相关基因,它在肝癌中的表达目前尚未见报道。本研究在胚胎肝、成人肝、肝癌及相应的癌旁组织中筛检和比较NET-1基因和蛋白表达,以探讨NET-1基因在肝癌表达的特征。方法:用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测3例胚胎肝、4例成人肝、4例验证肝癌组织和28例肝癌与相应癌旁组织中NET-1mRNA的表达,由四星图像分析系统软件检测NET-1基因mRNA的光密度。用基因生物工程方法制备NET-1多克隆抗体,并用激光共聚焦显微镜观察免疫荧光细胞化学检测培养的人肝癌细胞系SMMC-7721中NET-1抗体的表达,免疫组化法检测28例肝癌与癌旁组织中NET-1蛋白的表达。结果:(1)正常成人和胎儿肝组织中NET-1基因mRNA不表达,4例验证肝癌组织中NET-1基因mRNA均呈阳性表达;肝癌与癌旁组织中NET-1基因mRNA高表达,阳性率均为85.71%(24/28)。肝癌组织中NET-1mRNA的平均光密度显著高于癌旁组织(0.64与0.47,P<0.05)。(2)经激光共聚焦显微镜观察SMMC-7721细胞中NET-1抗体的表达定位于胞浆。(3)免疫组化检测NET-1多克隆抗体在同组肝癌和癌旁组织中NET-1蛋白检出率分别为96.43%(27/28)和71.43%(20/28),两者差异具有显著性意义(P<0.05)。(4)RT-PCR方法和免疫组化方法检测肝癌和癌旁组织中NET-1基因mRNA表达与蛋白表达两者之间阳性率无显著性差异,并呈显著性正相关(癌中r=0.48,癌旁r=0.40,均P<0.05)。结论:NET-1基因表达可能是肝癌发生的早期分子事件,该基因在肝癌诊断中可能有一定的参考价值。

NET-1、Ki67和CD34在胃癌组织中的表达及其临床病理意义

目的探讨胃癌组织中NET-1、Ki67和CD34表达的临床病理学意义。方法应用免疫组化二步法检测86例胃癌组织中NET-1、Ki67和CD34的表达,对三指标均阳性病例进行免疫组化三重标记法双染方法,原位检测三指标的表达特点和毗邻关系。所有病例随访60月以上。结果胃癌组织中NET-1、Ki67和CD34高表达分别为56.98%、74.42%和62.79%,三指标阳性表达呈显著正相关(P<0.01)。三指标高表达分别与肿瘤临床分期呈正相关(均P<0.05),与患者生存率呈负相关(均P<0.05),其3、5年生存率均显著低于相应的低表达组或阴性组(P<0.05,P<0.01)。NET-1、Ki67高表达分别与肿瘤分化呈负相关(均P<0.01)。NET-1、CD34高表达分别与癌浸润深度、淋巴结转移呈正相关(均P<0.05)。结论NET-1、Ki67和CD34在胃癌组织中高表达与癌细胞增殖、癌血管形成和预后差有关。

胃癌NET-1、Ki-67表达及意义

目的研究胃癌组织中NET-1和Ki-67表达与其预后的关系。方法分别应用免疫组化EnVision两步法检测86例胃癌组织中NET-1和Ki-67的表达,对两指标均阳性病例行免疫组化双标双染方法,原位检测两指标的表达特点和比邻关系。所有病例随访60月以上。结果胃癌组织中NET-1和Ki-67高表达分别为56.98%和74.42%,两指标阳性表达呈正相关(P<0.01)。两指标高表达分别与癌分化呈负相关(均P<0.01);与癌临床分期呈正相关(均P<0.05);与患者生存率呈负相关(均P<0.05),其3年、5年生存率均低于相应的低表达组或阴性组(P<0.05,P<0.01);NET-1表达还与癌淋巴结转移呈正相关(P<0.01)。结论NET-1、Ki-67基因蛋白高表达反映胃癌细胞群体增殖活性,上调癌进展,预后较差。

COX-2和NET-1基因蛋白在宫颈癌中表达的意义

目的 研究环氧合酶-2（COX-2）和NET-1基因蛋白在宫颈癌中的表达及与宫颈癌生物学行为的关系。方法 采用免疫组化SP法，检测COX-2和NET-1基因蛋白在50例宫颈鳞癌组织、36例宫颈上皮内瘤样病变（CINⅠ～Ⅲ级）及5例正常宫颈组织中的表达。结果 COX-2表达在宫颈浸润癌中明显高于C烈Ⅲ级和早期浸润癌（P〈0．01），而在CINⅢ级与早期浸润癌中无显著差异（P〉0．05）；COX-2阳性表达在低、中分化癌中均显著高于高分化癌（P〈0．01）；在淋巴结转移组中显著高于无淋巴结转移组（P〈0．01）。NET-1在CINⅢ级中表达显著高于CINI级和CINⅡ级（P〈0．01）。而CINⅢ级和宫颈癌比较无显著差异（P〉0．05）。NET-1阳性表达在淋巴结转移组明显高于无淋巴结转移组（P〈0．01）。宫颈癌中COX-2表达与NET-1表达呈正相关（P〈0．01）。结论 COX-2表达上调是宫颈癌演进中的常见的分子事件。可作为判断宫颈癌淋巴结转移的一个指标。NET-1的过表达可能是宫颈癌发生的早期分子事件，有可能成为宫颈癌早期诊断的组织标记。在宫颈癌中COX-2和NET-1基因蛋白之间有协同作用。

NET-1在结肠癌中的表达、临床意义和预后分析

目的探讨新四极体-1(NET-1)在结肠癌中的表达、临床意义及预后分析。方法收集50例结肠癌组织和50例癌旁正常组织,应用逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)和Western blot检测两组中NET-1 mRNA和蛋白质的表达情况,并应用免疫组化法(SP)检测NET-1在两组中的表达,分析NET-1在结肠肿瘤发生、发展中的作用,并随访、分析NET-1的表达与结肠癌患者生存的相关性。结果 RT-PCR结果显示NET-1 mRNA在结肠癌和癌旁正常组织中的表达水平分别为(0.95±0.07)和(0.26±0.04),差异有统计学意义( P =0.005);Western blot结果显示:NET-1蛋白在结肠癌和癌旁正常组织中的表达水平分别为(0.83±0.09)(0.22±0.03),差异有统计学意义( P =0.003);SP法结果表明NET-1蛋白在结肠癌和癌旁正常组织中的阳性表达分别为64.00%(32/50)和36.00%(18/50),差异有统计学意义( P <0.001);NET-1与肿瘤的TNM分期、脉管浸润、淋巴结转移及肝转移等病理参数密切相关;NET-1阳性组的中位生存时间为299 d(95% CI :230.07~303.93),阴性组的中位生存时间为387 d(95% CI :279.16~335.82),差异有统计学意义( P =0.031)。NET-1表达水平与结肠癌患者预后明显相关( RR =2.092, P =0.002)。结论 NET-1的异常表达在结肠癌病变的发生、发展中具有重要作用,且与患者的生存期亦明显相关,是结肠癌潜在的生物学指标。

宫颈癌及其癌前病变组织NET-1基因蛋白的表达及意义

目的:探讨宫颈癌及其癌前病变组织中NET-1基因蛋白的表达及意义。方法:应用免疫组化S-P法对50例宫颈鳞癌组织、36例宫颈上皮内瘤样病变(CINⅠ～Ⅲ级)及5例正常宫颈组织中的NET-1基因蛋白进行检测。结果:NET-1基因蛋白在正常宫颈组织中不表达,在CINⅢ中表达显著高于CINⅠ和CINⅡ(均P<0.01);在CINⅢ和宫颈癌中的表达阳性率分别为78.57%、76.00%,两组比较无显著差异(P>0.05);NET-1表达阳性率及阳性强度与宫颈癌淋巴结转移呈显著正相关(P<0.01)。结论:NET-1过表达可能是宫颈癌发生的早期分子事件,可作为CIN病情监测、处理的辅助指标;NET-1高表达赋予了癌细胞更显著的侵袭、转移潜能。

结直肠癌组织中CEACAM-1、NET-1的表达变化及其意义

目的探究癌胚抗原相关细胞黏附分子-1(CEACAM-1)和NET-1在结直肠癌中的表达变化、临床意义,同时分析二者致癌作用的相关性。方法收集河北北方学院附属第一医院50例结直肠癌患者癌组织和癌旁正常结直肠组织,用免疫组化法检测CEACAM-1和NET-1的表达,分析CEACAM-1和NET-1阳性表达与结直肠癌临床病理参数的关系,并初步探讨其致癌机制。结果结直肠癌组织和癌旁正常组织中CEACAM-1阳性表达分别为68%(34/50)和28%(14/50),两者相比,P<0.01;结直肠癌组织和癌旁正常组织中NET-1阳性表达分别为64%(32/50)和24.%(12/50),两者相比,P<0.01;CEACAM-1和NET-1的阳性表达与肿瘤浆膜浸润、TNM分期、血管浸润、淋巴结转移及肝转移紧密相关,P均<0.05;在结直肠癌组织中CEACAM-1、NET-1的表达呈正相关(r=0.497,P<0.01)。结论在结直肠癌组织中,CEACAM-1和NET-1表达均异常增高,均可作为评估结直肠癌发生、发展、转移的潜在生物学指标。

肝癌中NET-1基因表达和意义

目的 研究NET 1基因在人体组织中的表达 ,以确定该基因是否可作为恶性特异性的标记。方法 在 4 7种人类不同的正常组织与肿瘤组织cDNA中用RT PCR方法研究NET 1基因表达 ,进一步在 1 3例人肝正常组织与癌组织cDNA中用半定量PCR分析NET 1基因表达的意义。结果 胰腺、肝脏 (包括成人和胎儿肝 )、心、骨髓组织和造血细胞中NET 1阴性表达。 1 1种恶性肿瘤组织和细胞中 ,除了造血系统恶性肿瘤 (淋巴瘤和白血病 )外 ,其它组织均为NET 1阳性表达。特别在 4例肝癌组织标本中发现均有NET 1基因表达 (1 0 0 % ) ,2例癌旁肝组织显示一个弱的阳性信号。结论 NET 1基因在人体正常组织、肿瘤组织和细胞中表达不同 ,特别是NET 1基因表达于肝癌组织而不表达于正常肝组织。提示NET

肿瘤相关基因NET-1的研究进展

NET-1(tspan1)是新近被证实的四次跨膜蛋白超家族(transmembrane 4 superfamily,TM4SF)的成员之一。作为一种肿瘤相关基因,与肿瘤细胞的增殖、迁移、内吞作用和诱导血管形成密切相关。NET-1蛋白的异常表达可能是引起和维持癌恶性表型的原因之一,其表达水平对癌的预后具有评估价值,该基因可能成为肿瘤基因治疗的靶点。

胃腺癌组织中NET-1、FHIT及Ki-67的表达及其临床意义

目的探讨胃腺癌组织中NET-1、FHIT及Ki-67的表达,观察三者表达对患者生存预后的影响。方法对88例原发性胃进行手术,采用免疫组织化学方法对胃癌组织中的NET-1、FHIT及Ki-67蛋白表达进行检测,并观察上述蛋白表达与患者生存预后的关系。结果 NET-1、FHIT及Ki-67阴性表达组患者的平均术后生存时间分别为65.1、26.9、70.1个月,阳性表达组患者的平均术后生存时间分别为26.6、39.2、30.1个月。NET-1和Ki-67阳性组患者的术后生存时间短于阴性组(P<0.05);FHIT阳性组患者的术后生存时间高于阴性组(P<0.05)。结论 NET-1、FHIT及Ki-67蛋白的表达与胃腺癌患者预后密切相关,对分析胃癌的生物学行为和判断预后有重要意义。

脑星形细胞肿瘤微血管密度和NET-1蛋白的表达及其相关性

目的探讨脑星形细胞肿瘤组织中微血管密度(MVD)和NET-1蛋白表达的意义。方法应用免疫组化方法,检测65例脑星形细胞肿瘤组织和5例正常脑组织中,NET-1蛋白的表达以及血管内皮细胞表面抗原CD34单抗标记测定MVD,分析NET-1蛋白表达和MVD与脑星形细胞肿瘤分级关系。结果MVD与脑星形细胞肿瘤分级相关,NET-1阳性组MVD显著高于NET-1阴性组,NET-1表达强度与MVD呈高度正相关(rs=0.6682,P<0.05)。结论MVD可以是判断星形细胞瘤恶性程度指标之一,NET-1可能通过促进星形细胞肿瘤组织微血管形成发挥作用。

NET-1、Ki-67在肺腺癌组织中的表达及意义

WHO（2011）分类统计结果表明，鳞癌和腺癌约占肺恶性肿瘤的80％以上，且腺癌的发病率近年来有明显上升趋势。肿瘤相关分子基因NET-1属于四聚体超家族成员之一，在细胞信号传导、调节、增殖、分化及诱导血管形成过程中有着重要作用心.有文献报道，肝癌中NET—1过表达可以促进癌细胞异常增生与失分化，前列腺癌组织中特异性存在NET-1蛋白。

NET-1 shRNA抑制肺癌细胞A549中NET-1表达及对癌细胞增殖的影响

目的:探讨转染PSilencer4.1-NET-1 shRNA进入肺癌细胞株A549后对细胞中NET-1基因的表达及细胞增殖的影响。方法:转染PSilencer4.1-NET-1 shRNA进入肺癌细胞株A549,同时设立空转染对照组与空白组,Western blot检测细胞NET-1蛋白,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测癌细胞中NET-1mRNA的含量,WST-8法检测细胞的增殖,流式细胞仪检测细胞周期的相关变化。结果:PSilencer4.1-NET-1 shRNA转染组中NET-1 mRNA的含量及细胞NET-1蛋白与对照组比较明显降低,实验组细胞的增殖明显慢于对照组与空白组,癌细胞阻滞在G1期占63.24%,S期细胞比例明显下降,与对照组比较均有统计学意义(P<0.05)。结论:肺癌细胞中NET-1持续低表达可导致癌细胞增殖抑制、生长减慢,在肺癌患者的预后判断中有一定的参考价值。

NET-1表达与胃癌发展和预后关系

目的:研究NET-1基因蛋白在胃癌中表达及与胃癌临床病理因素和预后的关系。方法:通过自行设计制备的NET-1抗体,用免疫组化SP法检测86例胃癌组织中NET-1基因蛋白表达,结合临床病理因素和随访资料进行统计学分析NET-1表达对胃癌预后的影响。结果:NET-1在胃癌组织中均有表达,其强阳性表达率为56.98%,在癌中表达显著高于正常黏膜。NET-1强阳性表达与癌分化(P<0.01)以及患者生存率呈显著负相关(P<0.05),其中3年、5年生存率与中位生存期均显著低于其弱阳性组(P<0.05)。结论:NET-1基因表达能较好地反映胃癌细胞群体增殖活性,是一个重要的生物学标记,能显著上调和促进癌进展。实验设计制备的NET-1抗体将能较好的用于临床肿瘤的研究。

NET-1、ERRα在胃癌中的相关性及意义

目的研究胃癌组织中NET-1和雌激素受体相关受体(ERRα)表达相关性及意义。方法应用免疫组化法检测72例胃癌组织中NET-1和ERRα的表达,对两指标均阳性病例行免疫组化双标双染,原位检测两指标的表达特点和比邻关系。结果胃癌组织中NET-1和ERRα两指标阳性表达呈正相关;两指标高表达分别与癌分化呈负相关、与癌临床分期呈正相关;NET-1表达与癌淋巴结转移呈正相关;ERRα与患者生存率呈负相关。结论NET-1、ERRα是判断胃癌预后的有价值的标记物。

NET-1和MIB-1在肝癌中的表达及意义

目的:研究NET-1和MIB-1在肝细胞肝癌(HCC)中的表达意义,分析两者与HCC生物学行为的相关性。方法:采用间接免疫荧光细胞化学法结合激光扫描共聚焦显微镜检测肝癌细胞株SMMC-7721细胞中NET-1与MIB-1的定位表达;同时以免疫组织化学SP法和双标双染(DouS-P)法检测76例肝癌组织标本中NET-1与MIB-1的表达。结果:NET-1表达于肝癌细胞胞浆,MIB-1表达于肝癌细胞胞核。HCC中NET-1与MIB-1强阳性表达率分别为51.32%和38.16%,两指标表达呈正相关(rs=0.3342,P<0.01)。NET-1、MIB-1表达强度在不同HCC肿瘤病理分级、临床分期和是否伴有肿瘤淋巴结转移患者中差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。另外,不同HCC细胞学类型以及是否伴有肝炎肝硬化患者中,NET-1表达差异也具有统计学意义(P<0.01)。结论:NET-1作为胞浆蛋白在HCC中过表达,与MIB-1表达密切相关。提示NET-1为肿瘤增殖相关蛋白,在肿瘤中显著上调,并与HCC恶性生物学行为相关。

人类NET-1基因正、反义真核表达载体的构建及在肝癌SMMC-7721细胞中的表达

肝癌是全球发病率最高的恶性肿瘤之一，其中约55％发生在中国，至今仍缺乏有效的治疗手段。NET-1属于四次跨膜蛋白（TM4S）家族成员，具有显著上调癌形成的作用。在研究人体组织中NET-1表达及分析肝与肝癌组织NET-1表达差异的基础上，作者采用分子克隆和基因转染技术将构建的NET-1正、反义真核表达载体分别转染肝癌细胞SMMC-7721，为进一步探讨NET-1基因在肝癌发生发展中的作用提供实验模型。

脑星形细胞肿瘤中NET-1蛋白的表达及其病理意义

目的在脑星形细胞肿瘤中研究NET-1蛋白表达及其与临床、病理和预后的关系。方法应用免疫组化方法检测65例脑星形细胞肿瘤组织中NET-1蛋白的表达。结果NET-1蛋白只表达于脑星形细胞肿瘤中的肿瘤细胞,而在正常脑组织胶质细胞中无表达。在脑星形细胞肿瘤中NET-1蛋白的检出率为66.15%(43/65)。NET-1蛋白的表达与脑星形细胞肿瘤的病理分级密切相关,在高级别肿瘤中NET-1蛋白的表达率和表达强度均高于低级别肿瘤(P<0.05)。结论随着星形细胞肿瘤分化程度的降低,NET-1蛋白的表达显著增强;NET-1蛋白的高表达预示着星形细胞肿瘤患者预后不良,NET-1蛋白的表达可成为有价值的评估该肿瘤预后的指标之一。