阳离子脂质体介导NF-κB“decoy”ODNs转染巨噬细胞条件的优化

目的 :观察 NF- κB“decoy”ODNs在阳离子脂质体 lipofectin介导下转染小鼠巨噬细胞 J774 .1的优化参数以及在细胞内的分布。 方法 :改变 ODN与 lipofectin比率、转染时间 ;用流式细胞仪检测细胞内的相对荧光强度和摄取率评价转染效率 ;荧光显微镜观察细胞内荧光分布 ;测定细胞上清乳酸脱氢酶 (L DH)观察细胞损伤情况。 结果 :lipofectin介导转染显著提高 J774 .1细胞对 NF- κB“decoy”ODNs的摄取 ;在 2 4孔培养板中 ,NF- κB“decoy”ODNs与 lipofectin比率 (W/ W)为 1∶ 5、转染 6 h时 ,转染效率最佳而细胞毒性相对较低 ;lipofectin介导转染 6 h后 ,细胞内荧光物质主要聚集于细胞核和部分细胞质中 ,而直接转染时荧光物质多分布于细胞质。结论 :lipofectin可增加 NF-κB“decoy”ODNs的细胞摄入并改变其细胞内分布 ;NF-κB“decoy”ODNs与 lipofectin比率 (W/ W)为 1∶ 5、转染 6 h时可获得最佳转染效率。

NF-κB“decoy”寡核苷酸对LPS诱导巨噬细胞IL-10表达的影响

目的 :探讨NF -κB“decoy”寡核苷酸 (ODNs)对脂多糖 (LPS)诱导小鼠巨噬细胞株J774 .1表达IL - 10的影响。方法 :通过体外细胞培养技术 ,观察转染NF -κB“decoy”ODNs对LPS刺激巨噬细胞产生IL - 10及其表达的影响。结果 :在LPS刺激的巨噬细胞中转染NF -κB“decoy”ODNs对抗炎介质IL - 10的合成表达无影响。结论 :NF-κB“decoy”ODNs不抑制抗炎介质IL - 10的表达 ,可能由于NF -κB在IL - 10转录机制中不占主导地位。

NF-κB靶向性哑铃形“圈套”ODNs抑制大脑皮质神经元氧糖剥夺／复氧后TNF-α的表达

目的设计合成靶向哑铃形寡核苷酸(oligodeoxynucleotides,ODNs)圈套,检测其对大鼠大脑皮质神经元氧糖剥夺/复氧(OGD/R)后TNF-α表达的抑制效应。方法原代大脑皮质神经元体外培养,建立氧糖剥夺/复氧模型,以正常组、OGD4h/R6h组、NF-κB decoy ODNs组、无关decoy ODNs组、脂质体组为实验组,采用Western blot检测NF-κB p65蛋白表达,分别采用免疫细胞化学和逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)检测TNF-α蛋白和mRNA表达。结果Westernblot检测显示NF-κB decoy ODNs组NF-κB P65蛋白表达明显低于OGD4h/R6h组、脂质体组、无关decoy ODNs组(P<0.05),与OGD4h/R6h组、脂质体组、无关decoy组相比NF-κB decoy ODNs组TNF-α蛋白和mRNA表达明显降低(P<0.05);而脂质体组、无关decoy ODNs组对NF-κB P65蛋白、TNF-α蛋白和mRNA表达未见抑制(P>0.05)。结论靶向性NF-κB的哑铃形圈套ODNs可有效抑制大脑皮质神经元OGD/R后炎症因子TNF-αmRNA及蛋白的表达。

NF-κB decoy寡核苷酸联合阿霉素诱导裸鼠肝癌细胞HepG_2凋亡

目的:探讨NF-κB decoy寡核苷酸协同阿霉素对裸鼠肝癌细胞HepG2的作用及机制。方法:接种传代培养的人肝癌细胞HepG2于裸鼠皮下,局部注射NF-κB decoy寡核苷酸和/或阿霉素进行治疗。观测裸鼠瘤体大小变化,计算抑瘤率;HE染色观察肝癌组织结构和细胞形态改变;TUNEL法检测细胞凋亡。结果:NF-κB decoy寡核苷酸联合阿霉素治疗组裸鼠肝癌细胞的生长受到明显抑制,抑瘤率为80.52%;肿瘤重量、体积明显小于单用NF-κBdecoy寡核苷酸、阿霉素治疗组及对照组;联合组癌组织凋亡增加,凋亡指数为(39.8±1.6)%,与其余3组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:NF-κB decoy寡核苷酸协同阿霉素能抑制NF-κB活性,促进肝癌细胞凋亡,增加其对化疗药物的敏感性。

NF-κB的双元件诱饵ODN对大鼠颈动脉内膜增生的抑制作用

目的观察核因子(NF)-κB的双元件诱饵ODN序列对大鼠球囊损伤术后血管内膜增生及血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的作用。方法在大鼠主动脉行球囊导管扩张术,建立血管内膜损伤模型。将含有人工合成的NF-κB p65亚基的双元件诱饵ODN序列的混合液灌注入损伤部位。分别于3d和7d后观察血管内膜损伤修复情况。原代培养VSMC,用能够表达NF-κBp65亚基的双元件诱饵ODN序列的载体包装病毒并感染原代VSMC,MTT试验观察细胞增殖情况,高内涵分析检测细胞凋亡情况,Western Blotting检测NF-κB p65、白细胞介素(IL)-8、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1表达水平。结果球囊损伤术后灌注双元件ODN组血管内膜增生明显较灌注单元件ODN组及错序对照组降低。感染双元件ODN表达腺病毒载体的原代VSMC与感染单元件ODN表达载体及错序对照表达载体的原代细胞相比,细胞增殖水平明显降低,细胞凋亡明显增加,IL-8表达水平明显下调,而NF-κB p65表达水平无明显变化。双元件ODN组与单元件ODN组的MCP-1表达差异无统计学意义,但较错序对照组均明显降低。结论转染NF-κB p65亚基的双元件诱饵ODN序列可减轻损伤血管在修复过程中的血管内膜增生,这种效应可能由其对VSMC增殖的抑制作用所致。

NF-κB decoy寡核苷酸对人结肠癌细胞株SW480/ADM耐药性的逆转作用

目的探讨核转录因子κB(NF-κB)decoy寡核苷酸对人结肠癌细胞株SW480/阿霉素(ADM)耐药的逆转作用。方法应用脂质体转染方法将NF-κB decoy寡核苷酸质粒转入SW480及SW480/ADM细胞株并证实基因转入成功,MTT法检测SW480及SW480/ADM对ADM的药物敏感度并观察NF-κB decoy寡核苷酸对耐药的逆转程度。结果构建NF-κB decoy寡核苷酸有效,能降低核内NF-κB表达;核内NF-κB表达可以导致SW480耐药细胞株药物敏感度增高,并与剂量和时间相关。结论 NF-κB decoy寡核苷酸对人结肠癌细胞株SW480/ADM耐药有明显的逆转作用。

靶向NF-κB的圈套ODNs拮抗pMφTNFα表达的实验研究

目的 本实验设计合成靶向NF κB的哑铃形圈套ODNs,并验证其抗TNFα生成效应。方法 以阳离子脂质体为载体 ,将圈套ODNs转染大鼠pM细胞 6小时后用LPS(脂多糖 ) 10 μg ml刺激 ,用ELISA法及RT PCR法测圈套ODNs对TNFα蛋白及mRNA水平的影响。结果 哑铃形圈套ODNs可明显降低TNFα在mRNA及蛋白水平的表达。结论 靶向NF κB的哑铃形圈套ODNs具有下调炎性介质TNFα的表达。

Fucose-appended dendrimer/α-cyclodextrin conjugate as a novel NF-κB decoy carrier to Kupffer cells infulminant hepatitis mice induced by lipopolysaccharide

Fulminant hepatitis is a serious, life-threatening disorder and is associated with inflammatory cytokines produced by Kupffer cells. However, a number of clinical trials for the treatment of fulminant hepatitis did not show enough substantial benefits. Since NF-κB is a key mediator of inflammatory response in Kupffer cells, NF-κB decoy would be an attractive candi-datefor the treatment of fulminant hepatitis.

NF-κB双链寡脱氧核苷酸圈套对严重胸外伤挫伤肺超微结构的影响

目的研究NF-κB双链寡脱氧核苷酸圈套(NF-κB decoy ODN)对严重胸外伤肺挫伤血清NF-κB及肺组织超微结构的影响。方法 40只新西兰白兔随机分为:(1)A组,严重胸外伤肺挫伤(n=12);(2)B组,严重胸外伤肺挫伤NF-κB杂链decoy ODN治疗(n=12);(3)C组,严重胸外伤肺挫伤NF-κB正链decoy ODN治疗(n=12);(4)D组,正常无损伤对照(n=4)。建立严重胸外伤肺损伤模型,按实验分组分别将合成的正链、杂链NF-κB decoy ODN经颈内静脉注入,每只实验兔分别注射20μg。于挫伤后1、2、3、4 h检测血清NF-κB及肺组织超微结构病理的改变。结果肺挫伤后血清中NF-κB含量1h升高,4 h达高峰。经NF-κB正链decoyODN治疗后2 h,升高的NF-κB开始下降,3 h达最低值。超微结构病理结果显示,D组肺组织肺泡结构正常,Ⅰ、Ⅱ型细胞清晰,或毛细血管轻微充血;A组挫伤后1 h时肺泡及毛细血管充血,2 h时可见肺泡腔内白细胞,毛细血管充血严重,有轻微出血;3 h后肺泡腔破损中等出血,毛细血管充血严重;而B组于挫伤后1 h肺泡腔少量出血,肺泡壁毛细血管充血,2 h时肺泡腔毛细血管出血,有红、白细胞释放至肺泡腔,3 h后肺泡腔出血严重,可见板层小体空化,染色质凝集;C组在肺挫伤后1 h肺泡腔无出血,肺泡壁毛细血管仅少量充血,2、3 h时毛细血管充血,肺泡腔可见出血,4 h后可见充血明显的肺泡壁毛细血管,肺泡腔内仅见少量红细胞。各组组间比较,肺挫伤后均有不同程度充血出血,但经正链decoy ODN治疗后,肺泡腔出血明显减少,说明正链NF-κB decoy ODN可使急性肺挫伤组织病变减轻。结论对严重胸外伤肺挫伤早期给予NF-κB正链decoy ODN治疗,可使血清NF-κB表达减少,并减轻挫伤肺组织超微病变,对急性肺挫伤发展具有一定阻断作用。

NF-κB靶向性哑铃形圈套寡核苷酸抑制肾小球系膜细胞TGF-β_1的表达

目的 :设计合成靶向NF κB的哑铃形圈套ODNs,并检测其对NF κB转录活性和肾小球系膜细胞TGF β1 表达的抑制效应 .方法 :采用电泳迁移率改变实验 (EMSA)体外检测哑铃形圈套ODNs对NF κB转录活性的抑制效应 .提取大鼠肾小球系膜细胞 ,随机分为正常对照组、LPS刺激组、哑铃形圈套ODNs处理组、无关圈套ODNs处理组和脂质体处理组 .采用阳离子脂质体将 2 ,4 ,8mg/L不同剂量哑铃形圈套ODNs转染大鼠肾小球系膜细胞 ,6h后用LPS刺激 ,收集转染后 8,1 2 ,1 8h上清和细胞 .用酶联免疫吸附试验 (ELISA)法检测上清TGF β1 蛋白表达 ,逆转录PCR(RT PCR)法检测TGF β1 mR NA转录 .结果 :哑铃形圈套ODNs在体外能有效地抑制NF κB与其顺式元件的结合 ;4 ,8mg/L剂量哑铃形圈套ODNs可明显抑制LPS诱导的大鼠肾小球系膜细胞TGF β1 转录和表达 .结论 :靶向NF κB的哑铃形圈套ODNs在体外可抑制NF κB的转录活性 ,从而对体外培养的肾小球系膜细胞炎性因子TGF β1

NF-κB靶向性哑铃形“圈套”寡核苷酸抑制肾小球系膜细胞IL-6的表达

目的 设计合成靶向NF κB的哑铃形“圈套”ODNs ,并检测其对NF κB转录活性和肾小球系膜细胞IL 6表达的抑制效应。方法 采用电泳迁移率改变实验 (EMSA)体外检测哑铃形圈套ODNs对NF κB转录活性的抑制效应。提取大鼠肾小球系膜细胞 ,随机分为正常对照组、LPS刺激组、哑铃形圈套ODNs处理组、无关圈套ODNs处理组和脂质体处理组。采用阳离子脂质体将 2、4、8mg L不同剂量哑铃形圈套ODNs转染大鼠肾小球系膜细胞 ,6h后用LPS刺激 ,收集转染后 8、12、18h上清和细胞。用酶联免疫吸附试验 (ELISA)法检测上清IL 6蛋白表达 ,逆转录PCR(RT PCR)法检测IL 6mR NA转录。结果 哑铃形圈套ODNs在体外能有效地抑制NF κB与其顺式元件的结合 ;4、8mg L剂量哑铃形圈套ODNs可明显抑制LPS诱导的大鼠肾小球系膜细胞IL 6转录和表达。结论 靶向NF κB的哑铃形圈套ODNs在体外可抑制NF κB的转录活性 ,从而对体外培养的肾小球系膜细胞炎性因子IL

NF-κB靶向性哑铃形“圈套”寡核苷酸对海马神经元及神经元样细胞中COX-2表达的影响

目的设计合成靶向性NF-κB的哑铃形圈套ODNs,并检测其对神经元样细胞及海马神经元中NF-κB及环氧化酶-2(COX-2)的抑制作用。方法采用NF-κB靶向性哑铃形圈套ODNs转染培养的PC12细胞,用Western blot方法对PC12细胞内NF-κB和COX-2的蛋白表达进行分析;转染培养的海马神经元再经LPS刺激后,用RT-PCR法检测COX-2mRNA。结果经靶向性NF-κB哑铃形圈套ODNs处理的PC12细胞中NF-κB的表达明显降低(P<0.01),同时伴有COX-2表达明显减少(P<0.01);海马神经元中COX-2mR-NA的表达明显降低(P<0.01)。结论靶向性NF-κB的哑铃形圈套ODNs可抑制神经元样细胞及神经细胞中NF-κB和COX-2的表达,且NF-κB对COX-2具有调控作用。

糖尿病患者树突细胞中NF-κB活性改变及检测TNF-α意义

目的探讨糖尿病患者血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平及外周血树突细胞(DC)中NF-κB活性变化的意义。方法无偿献血员10例为正常对照组(N组),糖尿病患者20例分为IDM组和ODN组各10名。外周血分离单核细胞(PBMC),加入IL-4、GM-CSF对DC进行诱导培养,同时向ODN组中加入NF-κB特异性低脱氧核苷酸(ODN)培养细胞,采用ELISA法测定血液及培养上清中TNF-α的含量。免疫印迹分析检测DC中NF-κB p65的磷酸化水平,β-actin作为内参。结果糖尿病组患者的血清TNF-α水平显著高于正常对照组(P<0.001);培养物上清液TNF-α水平的测定结果为:N组和ODN组显著低于IDM组(P<0.05);N组和ODN组水平无显著差异(P>0.05);在N组和ODN组DC中NF-κB p65的磷酸化的表达水平显著地低于IDM组(P<0.05);N组和ODN组无显著差异(P>0.05)。结论提示炎症因子TNF-α及NF-κB可能参与糖尿病的病理生理过程。糖尿病患者外周血树突细胞中NF-κB p65的磷酸化水平可以被ODN抑制。

NF-κB靶向性哑铃形"圈套"寡核苷酸对肾小球系膜细胞TNF-α的表达抑制作用的研究

目的:本实验设计合成靶向NF-κB的哑铃形圈套ODNs,并检测其对肾小球系膜细胞TNF-α表达的抑制效应。方法:以NF-κB顺式作用元件κB序列为模板,设计包含两个拷贝的κB序列,长度为58个碱基的环状IDNs,合成后部分序列做FAM标记,行转染效率鉴定实验。提取大鼠肾小球系膜细胞,随机分为正常对照组、LPS刺激组、哑铃形圈套ODNs处理组、无关圈套ODNs处理组和脂质体处理组。采用阳离子脂质体将2、4、8 mg／L不同剂量哑铃形圈套ODNs转染大鼠肾小球系膜细胞,6h后用LPS刺激,收集转染后8、12、18上清和细胞。用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测上清TNF-α蛋白表达,逆转录PCR(RT-PCR)法检测TNF-αmRNA转录。结果:阳离子脂质体可将哑铃形圈套ODNs高效转染入肾小球系膜细胞;4、8mg／L剂量哑铃形圈套ODNs可明显抑制LPS诱导的大鼠肾小球系膜细胞TNF-α转录和表达。结论:靶向NF-κB的哑铃形圈套ODNs对体外培养的肾小球系膜细胞炎性因子TNF-α的表达具有抑制效应。

IL-1预刺激对反义IRAK-2寡核苷酸抑制NF-κB活化的影响

目的 研究白介素－１（ＩＬ－１）预刺激对反义受体相关激酶－２寡核苷酸（ＩＲＡＫ－２ＯＤＮ）抑制ＩＬ－１激活核因子－ｋａｐｐａ Ｂ（ＮＦ－κＢ）的影响。方法 实验分ＩＬ－１预处理组和非预处理组。以脂质体介导反义ＩＲＫＡ－２ＯＤＮ转染２９３细胞，以夹心酶联免疫吸附测定法（ＥＬＩＳＡ）检测ＮＦ－κＢ的含量。结果 ＩＬ－１非预处理组反义ＩＲＡＫ－２ＯＤＮ不能抑制ＮＦ－κＢ活性。

NF-κB decoy对人脐静脉内皮细胞组织因子表达及凝血因子Ⅶ激活抑制作用研究

目的 用decoy策略调控核因子κB(NF κB)调节组织因子 (TF)表达及相应的因子Ⅶ(FⅦ )活化 ,探讨冠心病新的防治方法。方法 用流式细胞术检测NF κBdecoy对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的转染效率 ,用凝胶迁移率改变竞争实验证实NF κBdecoy的作用机制 ,用RT PCR检测组织因子 (TF)mRNA ,流式细胞术检测HUVEC表面TF抗原 ,重组组织因子一期凝血法检测与HUVEC共孵育的血浆中活化因子Ⅶ (FⅦa)活性。结果 decoy能成功地转染入HUVEC内 ,能与TF启动子的κB位点顺式作用元件竞争性结合转录因子NF κB ,明显抑制肿瘤坏死因子α(TNFα)刺激的HUVECTFmRNATF抗原表达及相应的FⅦa活性。结论 NF κBdecoy能通过抑制TF表达而抑制FⅦ的激活 ,为冠心病的防治提供新的思路。

脂质体转染NF-κB诱捕物寡核苷酸抑制大鼠肝脏缺血再灌注损伤

目的探讨转染NF-κB诱捕物寡核苷酸(decoy ODN)对肝脏缺血再灌注损伤的影响。方法制作20只肝脏缺血再灌注SD大鼠模型,无序ODN对照组、decoy ODN实验组各10只。阻断肝脏血流后,实验组行脂质体包裹的NF-κBdecoy ODN溶液门静脉注射转染,对照组行脂质体包裹的无序ODN门静脉注射。开放肝脏血流后3h取出肝脏,应用病理学、EMSA和RT-PCR分别检测移植肝脏病理改变、肝脏组织NF-κB转录活性和TNF-αmRNA表达情况。结果实验组肝脏损伤减轻,肝细胞NF-κB转录活性、TNF-α mRNA表达较对照组明显减小或减少(均P<0.01)。结论 NF-κBdecoy ODN可有效抑制肝脏细胞NF-κB的激活从而抑制肝脏缺血再灌注损伤。

诱骗寡聚脱氧核苷酸在疾病治疗中的研究进展

诱骗寡聚脱氧核苷酸(decoy oligodeoxynucleotide,decoy ODN)通过与目的基因启动子上的转录因子结合位点(trascription factor binding site,TFBS)竞争性地结合转录因子,从而影响转录因子调控的靶基因表达。近年来,越来越多的研究者证实通过识别各种疾病相关的信号通路与转录因子,设计相应的decoy ODN,可以对一些疾病起到治疗效果,这其中包括运用STAT3 decoy ODN治疗恶性肿瘤和运用NF-κB decoy ODN治疗炎症纤维化疾病和心血管疾病。本文将总结分析近5年decoy ODN策略在疾病研究中的运用,为治疗肿瘤、纤维化、心脑血管病等疾病提供新的思路。

核因子κB诱捕抑制白细胞介素-1β诱导的软骨细胞生成一氧化氮的实验研究

目的探讨用核因子诱捕(decoy)方法抑制软骨细胞生成一氧化氮(NO)的可行性。方法培养大鼠软骨细胞,人工合成大鼠诱生型一氧化氮合酶(iNOS)基因上能够与核因子(NF)-κB序列识别和结合并带有荧光标记的特异性双链寡脱氧核苷酸(ODN)序列NF-κBdecoyODN,将不同浓度的NF-κBdecoyODN转染入培养的大鼠软骨细胞,通过荧光显微镜观察其转染效率及降解情况,检测其对白细胞介素(IL)-1β诱导的软骨细胞NO生成及iNOSmRNA转录的影响。结果NF-κBdecoyODN能转染入软骨细胞胞核并能维持一定时间,其中4μmol/L以上浓度的NF-κBdecoyODN能够有效抑制IL-1β诱导的软骨细胞iNOSmRNA的转录及NO生成。结论NF-κBdecoyODN能够转染入软骨细胞并抑制IL-1β诱导的软骨细胞iNOSmRNA的转录及NO生成,为抑制NO的生成提供了新的思路和方法。