AAV6-hNGFβ转染对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用与PI3K/Akt信号通路的关系

目的观察转染AAV6-hNGFβ对大鼠脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia/reperfusion injury)的保护作用与PI 3K/Akt信号通路之间的关系。方法健康雄性SD大鼠72只,体质量250~300g,随机分为4组(n=18),即假手术组、模型组、hNGFβ组(模型组+AAV6-hNGFβ-EGFP)和阴性对照组(模型组+AAV6-EGFP)。hNGFβ组、阴性对照组和模型组均采用脑缺血再灌注模模型,并于造模后分别在股静脉注射AAV6-hNGFβ-EGFP、AAV6-EGFP和等量0.9%氯化钠注射液,测定不同病程(1、2、4周)大鼠神经功能评分和脑梗死体积,TUNEL法检测神经细胞凋亡,以及脑内皮质NGF、Akt、p-Akt、Bcl-2和Bax的mRNA和蛋白表达水平。结果与假手术组比较,模型组大鼠神经功能评分,脑梗死体积和凋亡细胞数均显著升高,NGF表达显著下降,PI 3K/Akt通路受到抑制,Bcl-2蛋白表达显著降低,Bax蛋白表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,阴性对照组神经功能评分,脑梗死体积和凋亡细胞数无明显变化,NGF、Akt、p-Akt、Bcl-2和Bax表达水平接近;与模型组和阴性对照组比较,hNGFβ组大鼠神经功能评分,脑梗死体积和凋亡细胞数均显著降低,NGF表达显著升高,PI 3K/Akt通路得到激活,Bcl-2蛋白表达也显著升高,Bax蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。转染AAV6-hNGFβ-EGFP可提高NGF表达,激活大鼠PI 3K/Akt通路,提高Bcl-2蛋白表达,抑制Bax蛋白增加,对大鼠脑缺血再灌注损伤起到保护作用。结论转染AAV6-hNGFβ可激活大鼠PI 3K/Akt通路,上调Bcl-2蛋白同时抑制Bax蛋白表达,从而保护大鼠脑缺血再灌注损伤。

华佗健聪汤对Aβ所致老年痴呆大鼠海马Caspase-3活性及NGFβ含量的影响

目的:探讨华佗健聪汤防治Aβ所致老年痴呆的作用机理。方法:22月龄SD大鼠分成正常组、假损伤组、模型组、中药预防组、中药治疗组和阳性药物对照组,中药预防组和中药治疗组分别于造模前、后给予华佗健聪汤,阳性对照组造模后给予石杉碱甲片。用凝聚态Aβ1-42定向注射各组大鼠右侧海马CA1区制备出AD动物模型,用ELISA法检测各组海马Caspase-3活性及NGFβ含量。结果:中药预防组、中药治疗组与模型组相比,NGFβ含量明显增高,而Caspase-3活性明显降低,尤其是中药预防组,数值优于正常组和阳性药物对照组。结论:本方对AD的防治作用机理与促进NGF成熟和显著的抗凋亡作用密切相关。

辣木叶发酵物通过NGF/TrkA通路调控LC3、Beclin-1表达改善血管性痴呆小鼠学习记忆能力和神经功能

目的探究辣木叶发酵物通过神经生长因子(NGF)/神经营养因子受体A型(TrkA)通路调控微管相关蛋白1A/1B-轻链(LC)3、Beclin-1表达改善血管性痴呆(VD)小鼠学习记忆能力和神经功能。方法150只BALB/c小鼠随机分为5组:对照组,VD组,辣木叶发酵物低、中、高剂量组(辣木叶发酵物100、200、400 mg/kg灌胃干预),各30只。通过Himori法制备VD小鼠模型。28 d后进行水迷宫实验分析学习记忆功能。比较各组海马体损伤、LC3、Beclin-1、NGF、TrkA mRNA和蛋白表达水平。结果VD组目标象限停留时间、穿越平台次数、NGF、TrkA mRNA和蛋白表达水平显著低于对照组,而海马组织损伤及海马组织中LC3、Beclin-1 mRNA和蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.05)。辣木叶发酵物干预后,目标象限停留时间、穿越平台次数、NGF、TrkA mRNA和蛋白表达水平显著升高,其中辣木叶发酵物高剂量组>辣木叶发酵物中剂量组>辣木叶发酵物低剂量组,差异有统计学意义(P<0.05);海马组织损伤及海马组织中LC3、Beclin-1 mRNA和蛋白水平降低(P<0.05),其中辣木叶发酵物高剂量组<辣木叶发酵物中剂量组<辣木叶发酵物低剂量组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论辣木叶发酵物能够保护VD小鼠学习记忆功能,促进海马神经元中NGF/TrkA通路并抑制自噬。

五苓散对骶髓损伤后神经源性膀胱大鼠膀胱组织NGF/TrkA信号通路的影响

目的观察五苓散对骶髓损伤后神经源性膀胱大鼠膀胱组织中神经生长因子(NGF)/及其受体(TrkA)信号通路的影响,探讨五苓散改善骶髓损伤休克期后逼尿肌无反射型膀胱功能的可能机制。方法将60只雌性SD大鼠按随机数字表法分为假手术组(n=10)和造模组(n=50)。假手术组仅咬除椎板不横断脊髓,造模组采用改良的Hassan Shaker脊髓横断法建立骶髓损伤大鼠模型,选取32只造模成功的大鼠随机分为模型组和五苓散高、中、低剂量组,每组8只。中药治疗组从造模后第15天予以五苓散灌胃治疗,1次/d,连续治疗14 d。干预结束后取材,HE染色法观察膀胱组织病理形态学变化,免疫组织化学法检测膀胱组织NGF、TrkA的表达,Western blot法检测NGF、TrkA蛋白表达,实时荧光定量PCR法测定NGF、TrkA mRNA表达。结果模型组和五苓散高、中、低剂量组大鼠膀胱NGF、TrkA阳性表达、蛋白和mRNA相对表达量,与假手术组相比升高(P<0.05,P<0.01);五苓散中、高剂量组膀胱逼尿肌NGF、TrkA阳性表达、蛋白及mRNA表达水平较模型组升高(P<0.05,P<0.01),其中五苓散高剂量组显著升高(P<0.01);与低剂量组比较,五苓散高剂量组的阳性表达、蛋白和mRNA表达量显著升高(P<0.01);与五苓散中剂量比较,高剂量组阳性表达、蛋白和mRNA表达有所增加(P<0.05,P<0.01)。结论五苓散改善骶髓损伤后神经源性膀胱大鼠膀胱功能,其机制可能与五苓散上调膀胱组织NGF、TrkA表达,激活NGF/TrkA信号通路,帮助逼尿肌收缩相关。

Study on the Therapeutic Effects and Mechanisms of Human Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Carrying NGF Gene in Treating Ischemic Stroke in Rats

Objective:To investigate the therapeutic effects and mechanisms of human mesenchymal stem cell-derived exosomes(hMSCs-Exo)carrying the NGF gene in treating ischemic stroke in rats,aiming to provide new insights and treatment methods for ischemic stroke therapy.Methods:After successful construction of the cerebral ischemia model in 40 male SPF-grade SD rats aged 6-8 weeks,the model rats were randomly divided into 4 groups:Sham group,PBS group,hMSCs-Exo group,and NGF-hMSCs-Exo group,with 10 rats in each group.The rat MCAO model was prepared using the classic filament method,and NGF-hMSCs-Exo were injected via the tail vein into the MCAO model rats.The expression of the NGF gene in brain ischemic tissues,neuronal regeneration,and rat neurological function recovery were observed using TTC staining,memory function evaluation,Western blot,qRT-PCR,and other methods.Results:Compared with the Sham group,neurological deficits were significant in the PBS group(P<0.01).Compared with the PBS group,neurological scores improved in the hMSCs-Exo group and NGF-hMSCs-Exo group(P<0.05).Compared with the hMSCs-Exo group,the improvement in neurological deficits was more significant in the NGF-hMSCs-Exo group(P<0.05).The infarct area after NGF-hMSCs-Exo intervention was significantly reduced(P<0.05)compared with the Sham group.Compared with the PBS group,relative expression levels of NGF mRNA and protein decreased,while Caspase-3 mRNA and protein expression significantly increased in the PBS group(P<0.01).Compared with the PBS group and hMSCs-Exo group,there were differences in NGF and Caspase-3 mRNA and protein expression in the NGF-hMSCs-Exo group rat brain tissues(P<0.05).Conclusion:Treatment with human mesenchymal stem cell-derived exosomes carrying the NGF gene improves cognitive function and exerts protective effects on SD rats while inhibiting apoptotic levels in cells.

玉竹及其多糖对2型糖尿病大鼠血糖血脂及坐骨神经NGF mRNA表达的影响

目的:探索玉竹及其多糖对2型糖尿病大鼠血糖血脂及坐骨神经NGF mRNA表达的影响。方法:用高脂饲料联合链脲佐菌素构建2型糖尿病大鼠模型,建模后,空白组和模型组以生理盐水灌胃,玉竹多糖组予玉竹多糖0.5g/(kg·d)腹腔注射,玉竹中高剂量组分别予1.35、2.7 g/(kg·d)的剂量灌胃,二甲双胍组予0.5g/(kg·d)灌胃。治疗4周后,测定餐后0、2 h血糖,取胰脏做病理切片,测定血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)水平和坐骨神经NGF mRNA的相对表达量。结果:玉竹及其多糖干预后,大鼠胰岛细胞排列较为紧密,坏死细胞减少,餐后2h血糖除了玉竹中剂量组外均明显降低(P<0.05),餐后0 h血糖、TG水平均降低(P<0.05),坐骨神经NGF mRNA相对表达量增高(P<0.01)。结论:玉竹及其多糖通过改善胰脏功能,提高降糖降脂作用,其防治糖尿病局部神经病变的机制可能与上调坐骨神经NGF mRNA表达水平有关。

抑郁症大鼠海马和顶叶皮质神经元NGF含量及其mRNA的表达

目的 :观察实验性抑郁症大鼠脑内神经生长因子含量及其 m RNA表达的变化。 方法 :采用长期不可预见性中等强度应激造成大鼠抑郁症模型。运用 openfield法观察大鼠行为学变化 ,运用免疫组化和原位杂交法观察神经元 NGF含量及其m RNA表达的变化。 结果 :与对照组相比 ,抑郁组大鼠海马和顶叶皮质神经元 NGF免疫阳性颗粒数目减少 ,着色浅淡 ;NGFm RNA杂交阳性信号减少。 结论 :实验性抑郁症大鼠海马和顶叶皮质神经元 NGF含量下降 ,NGF m RNA表达水平降低。

三七总皂苷对大鼠脑缺血再灌注后脑内NGF和bFGF表达的影响

目的:观察三七总皂苷(PNS)对局灶性脑缺血再灌注后脑组织神经生长因子(NGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)蛋白表达的影响。方法:采用线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞局灶性脑缺血再灌注模型。实验动物随机分为假手术组、脑缺血再灌注模型组、模型+PNS治疗组和模型+尼莫地平治疗组。用免疫组织化学方法检测脑内皮质、海马等区域NGF和bFGF蛋白表达。结果:缺血2h再灌注46 h后,脑内海马和皮质区的NGF表达降低,PNS能显著上调海马、皮质区及丘脑区域NGF的表达。缺血2h再灌注46h后,bFGF的表达各脑区无明显差异;但PNS能显著上调缺血再灌注损伤后胼胝体区域内bFGF的表达。结论:局灶性脑缺血再灌注后,PNS能上调缺血脑组织内NGF和bFGF表达,尤其是促进了NGF的表达,这可能是PNS对脑缺血后损伤神经元的保护机制之一。

脑络欣通及其拆方对脑缺血再灌注大鼠NGF、PI3K、Akt以及Bad蛋白表达的影响

目的观察局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠缺血半暗带NGF、PI3K、Akt以及Bad蛋白的动态表达及脑络欣通(黄芪、川芎、三七、蜈蚣等)对其影响。方法以线栓法阻塞大鼠左侧大脑中动脉,复制局灶性脑缺血再灌注模型,缺血2 h再灌注3、7、14 d,用免疫组化染色SABC法分别检测缺血半暗带NGF、PI3K、Akt、Bad的表达。结果与模型组相比,脑络欣通组在脑缺血再灌注3、7、14 d后,能够明显增加PI3K、Akt的表达(P<0.01或P<0.001);在再灌注7、14 d,脑络欣通组NGF蛋白表达显著升高(P<0.05或P<0.01);再灌注14 d,脑络欣通组Bad蛋白表达显著减少(P<0.05)。结论脑络欣通能够保护脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织,其作用机制可能与促进NGF表达,激活PI3K/Akt通路并降低Bad蛋白表达有关。

BDNF、NGF对AD模型鼠脑移植区胚胆碱能神经元发育生长的调控

目的探讨脑源性神经营养因子（ＢＤＮＦ）、神经生长因子（ＮＧＦ）对ＡＤ模型鼠脑植入胚基底前脑后行为改善和移植区胚胆碱能神经元发育生长的影响。方法用使君子酸损毁ＳＤ大鼠基底大细胞核制成ＡＤ模型，分成ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ＋ＮＧＦ及单纯移植对照４组。在额、顶叶皮质植入同种胚基底前脑细胞悬液，前３组含相应神经营养因子，移植后每２ｄ向侧脑室灌注相应神经营养因子共７次。移植后１、２．５和４个月时行避暗回避试验和跳台试验，最后脑切片经ＡＣｈＥ组织化学、ＣｈＡＴ和ＬＮＧＦＲ免疫组织化学等染色，对移植区中的神经元及纤维作定量分析和图像处理。结果移植后应用神经营养因子的动物较对照组行为改善明显迅速，ＢＤＮＦ＋ＮＧＦ组行为改善又较ＢＤＮＦ组或ＮＧＦ组明显。形态学证实，应用神经营养因子动物移植区中ＡＣｈＥ阳性神经元数、１６９００μｍ２网格中ＡＣｈＥ阳性纤维交点数及ＡＣｈＥ阳性神经元面积均优于对照组，ＢＤＮＦ＋ＮＧＦ组的结果又好于ＢＤＮＦ组或ＮＧＦ组。结论ＢＤＮＦ与ＮＧＦ一样能促进植入胚基底前脑的ＡＤ模型鼠行为改善和移植区胚胆碱能神经元的发育生长，ＢＤＮＦ和ＮＧＦ联合使用比单独使用一种因子更为有效。

雌激素对老年大鼠小脑ER、ChAT、NGF表达的影响

【目的】探讨雌激素对大鼠小脑内雌激素受体(ER)、神经生长因子(NGF)和胆碱乙酰转移酶(ChAT)表达的影响。【方法】运用超敏感的免疫组织化学SP法,以老年SD大鼠小脑为研究对象,通过补充17β-雌二醇对ER、NGF和ChAT在小脑中的表达和分布变化进行研究。【结果】ER、NGF和ChAT免疫阳性反应物分布于小脑的蒲肯野氏细胞层、小脑齿状核、小脑间位核和小脑室顶核,ER阳性产物主要定位于细胞胞浆和突起中,也存在于胞膜和胞核中。老年大鼠小脑皮质及小脑核中ER、NGF和ChAT的表达强度及阳性细胞数量总趋势是显著降低,而补充17β-雌二醇后三种阳性产物的强度和阳性细胞数目显著回升,蒲肯野氏细胞的阳性突起长度和数量也呈此变化趋势。【结论】雌激素可促进NGF和ChAT的表达,在维持和保护小脑神经元的结构和功能中发挥了重要作用;另外ER、NGF和ChAT表达变化的相似性提示三者在雌激素对小脑的作用中是相互调节和影响的,同时表明雌激素在小脑发挥作用可能既通过基因组机制,也通过非基因组机制途径。

CGRP和NGF对短暂性全脑缺血后再灌注大鼠纹皮质Caspase-3蛋白表达的影响

为了探讨外源性降钙素基因相关肽 ( CGRP)和神经生长因子 ( NGF)对短暂性全脑缺血后再灌注大鼠纹皮质 Caspase-3蛋白表达的影响 ,在全脑缺血后再灌注模型上 ,应用免疫组织化学结合显微图象分析方法检测了 Caspase-3蛋白表达。结果发现 ,假手术组大鼠纹皮质未见 Caspase-3表达 ;缺血组较假手术组 Caspase-3表达显著增加 ( P<0 .0 1) ;CGRP组和 NGF组 Cas-pase-3表达均弱于缺血组 ( P<0 .0 5 ) ;CGRP和 NGF合用组 Caspase-3表达明显弱于缺血组 ( P<0 .0 1) ,分别弱于 CGRP组 ( P<0 .0 5 )和 NGF组 ( P<0 .0 5 )。缺血组缺血后再灌注 3 h Caspase-3开始表达 ,1d达高峰 ,3 d时减弱 ,CGRP和 NGF合用组 Cas-pase-3表达随着缺血后再灌注时间的延长而逐渐减弱。以上结果提示 :CGRP和 NGF分别抑制全脑缺血后大鼠纹皮质 Caspase-3蛋白表达 ,联合应用则能显著抑制全脑缺血后大鼠纹皮质 Caspase-3蛋白表达 。

人参皂甙对NGF引导的鼠胚脊髓神经节细胞轴突生长的影响

通过 NGF引导下鼠胚脊神经节体外培养模型的建立 ,观察 9种主要人参皂甙单体对感觉神经元轴突生长的影响。植块法鼠胚脊神经节体外培养 ,确定轴突生长所需 NGF的最低维持浓度 ,建立 NGF引导下鼠胚脊神经节体外培养模型 ,研究 9种主要人参皂甙单体 (Rb1 ,Rb3,Rd,Re,Rf,Rg1 ,Rg2 ,Rh1 ,Rh2 )对脊神经节轴突生长的作用。结果提示人参皂甙 Rg1 ,Rb1 ,Re,Rf。

NGF诱导PC12细胞早期分化的DIGE分析

目的筛选神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)处理后PC12细胞分化早期相关蛋白,寻找NGF药物作用靶点,为深入进行神经保护药物的研发提供理论依据。方法在建立NGF诱导PC12细胞分化模型的基础上,分别提取NGF处理前后的细胞总蛋白,应用荧光差异凝胶电泳(Differential Gel Electrophoresis,DIGE)系统获得蛋白点表达差异信息,运用MALDI-TOF质谱鉴定出差异蛋白质。结果NGF处理组有7个蛋白点发生变化;通过数据库检索,鉴定了3种结构和功能各异的蛋白。结论eEF-2、Rab GDIα和DPP与NGF诱导PC12细胞分化早期过程有关,可能是NGF的作用靶点。

NGF、BDNF及受体trkA、trkB、trkC在正常猴脊髓的表达

采用免疫组织化学方法观察了神经生长因子 (NGF) ,脑源性神经营养因子 (BDNF)以及 NGF家族因子受体 trk A、trk B、trk C的免疫阳性反应在正常猴脊髓的分布。结果表明 :NGF免疫反应阳性的神经元在脊髓灰质各层中均有分布 ,灰、白质内也可见较多的 NGF免疫反应阳性的胶质细胞。 BDNF在脊髓各型神经无有明显的表达 ,特别是前角运动神经元。 trk A、trk B、trk C的免疫阳性反应产物主要分布在灰质的神经元及胶质细胞。本实验结果揭示了在正常猴脊髓中神经营养因子 (NGF、BDNF )及受体 trk A、trk B、trk C的表达状况 ,提示这些神经营养因子及受体在维持猴脊髓神经元的正常生理功能中具有重要作用。

NGF与CNTF促进周围神经轴浆运输功能恢复的比较研究

目的: 比较神经生长因子 (nervegrowthfator, NGF) 与睫状神经营养因子 (cili aryneurotrophicfactor, CNTF) 对周围神经轴浆运输功能恢复的促进作用。方法: 利用自行研制的梭形双通道桥接管桥接 32只SD大鼠坐骨神经长 10mm缺损。将动物随机分为 2组。A组: 医用几丁糖凝胶组; B组: 医用几丁糖凝胶+NGF和医用几丁糖凝胶 +CNTF。术后 12、16周对再生神经行辣根过氧化物酶和核黄逆行示踪, 并取再生神经行Holmes银染。结果: 术后 12、16周, Holmes银染观察到A组两支管内再生纤维无明显差异, B组CNTF侧再生纤维较NGF侧再生神经外膜薄, 排列整齐, 粗细均匀; 辣根过氧化物酶和核黄显示: 与NGF侧相比,CNTF侧再生神经示踪后, 脊髓内被标记的阳性神经元数目多, 分布稠密。结论: CNTF对周围神经再生纤维形态结构和轴浆运输功能的恢复均优于NGF。

补肾方药诱导BMSCs移植对脑缺血损伤NGF、BDNF、VEGF表达的影响

目的观察补肾方药血清诱导大鼠BMSCs移植对脑缺血损伤大鼠脑组织神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达水平的影响作用。方法用线栓法制备大脑中动脉闭塞模型,随机分为模型组,单纯BMSCs移植组,左归丸、右归丸、地黄饮子、维甲酸诱导BMSCs移植组,另设假手术对照组。尾静脉移植用不同药物血清孵育BMSCs,移植后3 d和7 d处死大鼠,用ELISA法检测脑组织匀浆上清液中NGF、BDNF、VEGF的含量。结果第3天,与假手术组比较,模型组BDNF明显升高(P<0.05);与模型组比较,BMSCs移植各组VEGF明显升高(P<0.01),且药物孵育BMSCs移植各组NGF、BDNF明显升高(P<0.05,P<0.01);第7天,与假手术组比较,模型组NGF、BDNF明显升高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,BMSCs移植各组NGF、BDNF、VEGF明显升高(P<0.01);与右归丸组比较,左归丸、地黄饮子组NGF、BDNF明显升高(P<0.01)。结论不同补肾法方药血清孵育BMSCs均可促进脑缺血损伤大鼠脑组织匀浆上清液中NGF、BDNF、VEGF的表达,且补阴和阴阳双补方药诱导BMSCs组中表达的NGF、BDNF作用优于补阳类方药。

生后不同时期大鼠坐骨神经NGF基因的表达

采用 RT-PCR方法半定量分析生后 1、15、3 0、60、12 0和 3 60 d大鼠坐骨神经中 NGF m RNA表达的变化。结果表明 ,大鼠生后 1d坐骨神经中即有 NGF m RNA的表达 ;随着生后发育过程 ,NGF m RNA的表达量逐步增加 ,并呈严格单调上升的趋势。开始时增加速度较慢 ,但随鼠龄的增加而逐渐加快 ,至 49d时达到最快 ,然后逐渐减慢 ,到 12 0 d时已接近生后稳定表达水平。

NGF和GDNF基因重组逆转录病毒体外感染神经干细胞及其鉴定

目的 探讨神经干细胞 (NSC)直接作为基因靶细胞能否被重组逆转录病毒感染以及感染后目的基因的表达。 方法 分别用NGF和GDNF基因重组逆转录病毒上清液感染NSC 2d ;G418筛选后加入bFGF扩增培养 ;取感染后的NSC培养液 (NGF GDNF条件培养液 )培养PC12细胞和中脑腹侧神经元 ;用免疫组织化学染色方法检测中脑腹侧多巴胺神经元的形态改变以及感染后NSC对目的基因的表达。 结果 经G418筛选后 ,约 5 0 %感染NGF和GDNF基因重组逆转录病毒的NSC呈G418抗性 ;这些感染后的NSC开始分化 ,分裂球向四周长出放射状突起 ,部分细胞沿突起向外迁移生长 ;感染NGF基因的NSC呈星形 ,胞体较大 ,突起较粗。感染GDNF基因的NSC呈梭形 ,胞体较小 ,突起较长。经NGF条件培养液培养的PC12细胞 ,数量增多 ,突起明显变长。经GDNF条件培养液培养的中脑多巴胺神经元 (TH阳性细胞 )其胞体亦增大 ,突起伸长。大部分G418抗性的NSC出现NGF和GDNF免疫染色。 结论 神经干细胞可直接作为基因靶细胞 ,能被NGF和GDNF基因重组逆转录病毒有效感染而表达和分泌有生物学活性的NGF和GDNF。