基于蛋白质组学探讨Ppp3cb和Ppm1g在NHE1基因敲除模型鼠海马组织中的表达

目的通过NHE1基因敲除模型鼠的海马组织差异蛋白质组学分析,发现并明确Ppp3cb和Ppm1g的表达特征。方法①选取6只2周龄NHE1基因敲除模型鼠作为模型组,同周龄野生型小鼠6只作为对照组,采用琼脂糖凝胶电泳检测其基因型;应用旷场实验和强迫游泳实验对模型组和对照组小鼠进行行为学评估,并按照Racine评分标准对模型鼠进行癫痫发作分级;②通过串联质谱分析技术对模型组和对照组的海马组织进行差异蛋白筛选,基因本体论(Gene Ontology Analysis,GO)分析差异蛋白并进行注释和富集,蛋白网络数据库(search tool for the retrieval of interesting genes,STRING)分析差异蛋白之间的蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI);③应用qPCR和Western blot检测Ppp3cb和Ppm1g的转录和翻译水平,应用免疫组织化学技术分别观察其在组织中的表达量。结果①模型组小鼠NHE1基因未见表达,旷场实验中模型鼠的运动总距离较对照组减少(P=0.0073),跨越的格子数比对照组显著减少(P<0.0001)。强迫游泳实验结果显示,模型鼠不动的时间明显延长(P<0.0001);②以表达倍数(FC)≥1.2倍且P<0.05为筛选标准,检测到海马组织中845个差异表达的蛋白质点,其中有9个蛋白表达上调,7个蛋白表达下调。其中Ppp3cb下调,Ppm1g上调。GO功能注释结果表明,NHE1敲除后,分子功能(MF)富集在蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性的差异最显著,细胞成分(CC)富集在质膜部分的差异蛋白数量最多,生物过程(BP)富集在负向调节生物过程、免疫系统过程的差异蛋白数量最多。STRING分析显示差异蛋白Ppp3cb和Slc9a1直接作用,Ppm1g通过Ppp3cb和Slc9a1间接作用,Ppp3cb和Ppm1g之间相互作用。③Ppp3cb的转录和翻译水平减少,在组织中的表达量下降,而Ppm1g转录和翻译水平增加,在组织中的表达量上升(P<0.05)。结论本研究确定了NHE1基因敲除小鼠海马组织中差异蛋白Ppp3cb表达下调,而Ppm1g表达上调,为进一步研究Ppp3cb和Ppm1g参与癫痫发病机制提供了依据。

薯蓣皂苷对缺血性脑损伤模型大鼠cAMP/PKA通路、NHE1和GLUTs蛋白的调控作用

目的探究薯蓣皂苷对缺血性脑损伤模型大鼠环腺苷酸(cAMP)/蛋白激酶(PK)A通路、葡萄糖转运蛋白(GLUTs)、1型Na^(+)/H^(+)交换蛋白(NHE1)的调控作用。方法60只SPF级雄性SD大鼠,随机分为假手术(J)组、模型(MCAO)组、尼莫地平(N)组(15 ml/kg)、薯蓣皂苷高、中、低剂量(H、M、L)组(200、100、50 mg/kg),每组10只,线栓法构建大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)再灌注模型,造模成功后灌胃给药7 d(1次/d)。测定各组大鼠神经功能评分,Western印迹检测脑组织中GLUTs和NHE1蛋白水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测脑脊液cAMP、PKA水平。结果与J组比较,MCAD组神经功能评分显著增高,脑脊液中cAMP、PKA含量显著降低,GLUTs表达水平显著减少,NHE1表达水平显著升高(均P<0.01)。与MCAO显著组相比,H、M、L组能显著改善神经病学症状(P<0.01,P<0.05),显著升高cAMP、PKA含量及GLUTs表达水平,并显著降低NHE1表达水平(P<0.01,P<0.05),其中H组效果最佳,与N组接近。结论薯蓣皂苷可通过上调cAMP/PKA通路,升高GLUTs、降低NHE1水平,来缓解MCAO模型大鼠脑组织缺血缺氧,保护脑组织。

白术内酯Ⅰ通过SGLT1/NHE3通路治疗腹泻的机制研究

目的:探讨白术内酯Ⅰ通过SGLT1/NHE3通路治疗腹泻的机制。方法:Caco-2细胞建立体外肠道吸收模型,将细胞分别设为空白对照组、抑制剂(SGLT1抑制剂根皮苷、P38MAPK抑制剂SB203580、Ezrin抑制剂NSC668394)组、白术内酯Ⅰ组、白术内酯Ⅰ+抑制剂组,采用2-NBDG测定白术内酯Ⅰ对Caco-2细胞葡萄糖摄取的影响;Western Blot法检测SGLT1、p-P38MAPK、p-MAPKAPK2、p-AKT2、p-Ezrin、MLCK、p-MLC、NHE3等蛋白表达,荧光定量PCR检测SGLT1、MLCK、NHE3 mRNA表达。结果:白术内酯Ⅰ促进Caco-2细胞葡萄糖摄取,上调SGLT1、NHE3、MLCK的表达;此外,白术内酯Ⅰ增加了MLCK和P38MAPK/Ezrin信号通路中的蛋白磷酸化。结论:白术内酯Ⅰ可激活SGLT1促进Caco-2细胞葡萄糖摄取,通过P38MAPK/Ezrin信号通路上调其下游靶点NHE3和MLCK促进水钠吸收是其治疗腹泻的机制之一。

人NHE-1基因反义真核表达载体的构建及初步鉴定

目的 构建人Na+ H+ 交换蛋白 1(Na+ H+ exchanger 1,NHE 1)基因反义真核表达载体。方法 采用分子克隆技术 ,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶从NHE 1cDNApEAP切下所需目的片段 ,然后将该片段反向插入真核表达载体pcDNA3 1( ) Zeo的多克隆位点 ,最后对产生重组子进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果 经琼脂糖凝胶电泳鉴定 ,将目的片段成功的连接到pcDNA3 1( ) Zeo载体上。结论 成功地将NHE 1目的片段反向插入到pcDNA3 1( ) Zeo中 ,构建了人NHE 1反义表达真核载体hNHE 1。

NHE1蛋白在胃癌和胃癌前病变中的表达及临床意义

目的 检测NHE1蛋白在胃癌和胃癌前病变中的表达情况 ,初步探讨NHE1蛋白在胃粘膜癌变过程中的变化规律及其临床意义。方法 采用免疫组织化学方法检测NHE1蛋白在胃癌和胃癌前病变中的表达 ,其中正常胃粘膜15例 ,慢性萎缩性胃炎 15例 ,肠上皮化生 15例 ,异型增生 8例 ,胃癌 40例。结果 15例正常胃粘膜无表达 ,15例慢性萎缩性胃炎中有 2例表达 ,阳性率为 13 3 3 % ,15例肠上皮化生中有 3例表达 ,阳性率为 2 0 0 0 % ,8例异型增生中有 2例表达 ,阳性率为 2 5 0 0 % ,40例胃癌中有 3 3例表达 ,阳性率为 82 5 0 % ,胃癌与正常胃粘膜和各型胃癌前病变相比 ,具有显著性差异 (P <0 0 1)。结论 NHE1蛋白在胃癌的表达显著高于正常胃粘膜和胃癌前病变 ,可能与胃癌的发生、生长、转移有着密切的关系。

NHE-1核酶基因转染对大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡的影响

目的 探讨NHE 1核酶基因转染对大鼠肺动脉平滑肌细胞 (PASMC)凋亡的影响。方法 构建NHE 1核酶基因逆转录病毒载体 ,转染体外培养的大鼠PASMC ,应用半定量RT PCR法 (sqRT PCR)测定细胞内NHE 1mRNA的表达、BCECF法测定pHi、流式细胞仪测细胞周期、电镜及原位细胞凋亡检测 (TUNEL法 )观察细胞凋亡情况。结果 转染NHE 1核酶基因的细胞 ,NHE 1mRNA表达量及pHi较空载体转染细胞及未转染细胞显著降低 ,细胞凋亡率显著增加 ,电镜示细胞凋亡 ,凋亡小体形成。结论 NHE 1核酶基因转染可通过NHE 1抑制、细胞内酸化 ,显著诱导肺动脉平滑肌细胞凋亡。

过表达NHE1通过上调钙蛋白酶活性降低RAW264.7细胞ABCA1蛋白表达

目的探讨过表达钠氢交换体1(NHE1)对RAW264.7细胞三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)蛋白表达的影响。方法采用Ad NHE1腺病毒感染RAW264.7细胞,Western blot法检测NHE1-EGFP融合蛋白的表达,激光共聚焦显微镜技术检测NHE1-EGFP融合蛋白细胞内定位,酸负载p H回复检测NHE1活性,Western blot法检测NHE1-EGFP融合蛋白对RAW264.7细胞ABCA1蛋白水平及钙蛋白酶(calpain)活性的影响,加入calpain抑制剂N-乙酰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-正亮氨酸(ALLN),Western blot法检测肝脏X受体激动剂TO-901317诱导ABCA1蛋白表达水平的影响。结果 Ad NHE1腺病毒感染RAW264.7细胞后,高表达NHE1-EGFP融合蛋白,定位在细胞质及细胞膜。NHE1-EGFP融合蛋白可降低ABCA1蛋白的表达水平并提高calpain活性,而calpain抑制剂ALLN能阻断ABCA1蛋白表达水平降低。结论 NHE1过表达通过上调calpain活性而降低ABCA1蛋白表达水平。

NHE-1反义基因对胃癌细胞的酸化作用及其意义

目的探讨Na+-H+交换泵-1(Na+-H+exchanger1,NHE-1)反义基因转染对人胃癌细胞内pH值(intracellu-larpH,pHi)的调节作用及其在肿瘤基因治疗中的价值。方法构建人NHE-1基因反义真核表达载体,采用脂质体法将其转染至SGC-7901胃癌细胞中,采用荧光探针检测转染前后细胞内pH值的变化以及对细胞增殖和凋亡的影响。结果转染反义基因的细胞pHi明显降低,增殖能力降低,细胞凋亡率增加。结论NHE-1基因的表达在肿瘤细胞pHi及增殖和凋亡调节中起重要作用。

NHE1在心肌肥大,心肌纤维化和心衰中的作用

心肌肥大、心肌纤维化是多种慢性心衰的共同病理学改变,钠氢交换体1(NHE1)是多种因子介导的心肌肥大和心肌纤维化的信号转导通路上的共同途径,直接参与了其病理生理学过程,这些因子包括多种生长因子、肾上腺素能受体激动剂、血管紧张素、内皮素、凝血酶以及直接作用于细胞上的机械性张力。从理论推理和实验学证据两方面研究NHE1参与心肌肥大、纤维化和心衰的机制具有重要的意义。

人肺癌组织细胞NHE-1 mRNA表达及其意义的研究

目的 :研究人肺癌组织细胞NHE - 1基因表达水平 ;探讨人肺癌细胞在整体条件下PHi调节的分子机制及其生物学意义。方法 :以半定量逆转录PCR研究了 1 4例人肺癌组织手术新鲜标本的NHE - 1mRNA的表达水平。结果 :人肺癌组织细胞NHE - 1mRNA表达水平非常显著地高于正常肺组织 (p <0 0 0 1 ) ,系正常肺组织的 1 1 81倍。结论 :人肺癌组织细胞通过上调NHE - 1基因超表达 ,以增强Na+ /H+ 交换 ,可能是其在整体条件下PHi调节的主要分子机制和特点。

腺苷通过NHE-1/CaN途径拮抗大鼠低氧性右心室心肌肥厚

目的观察腺苷及其激动剂拮抗右心室肥厚的作用,并探讨其作用机制。方法 56只Sprague-Dawley大鼠随机分成常氧对照组、低氧对照组、低氧处理组（低氧＋腺苷组、低氧＋腺苷A1受体激动剂（CPA）、低氧＋腺苷A2受体激动剂（NECA）、低氧＋CPA＋A1受体阻滞剂（DPCPX）、低氧＋NECA＋A2b受体抑制剂MRS1754组）。大鼠置于低氧仓（氧浓度为9.5%~10.5%）连续低氧21 d。各处理组于低氧第7天使用植入式胶囊渗透压泵给药,持续时间为14 d,实验终点时,测定大鼠右心室肥厚程度,采用PCR法检测右心室心肌组织中NHE-1 mRNA、CnAβmRNA的相对含量。结果 1、慢性低氧对照组大鼠RV/（LV＋S）为0.369±0.033、RV/BW比值为0.75±0.095,均明显高于常氧组（0.271±0.010,0.59±0.039）（均P〈0.001）及低氧腺苷处理组（0.281±0.022,0.650±0.077）（P〈0.001,P=0.025）低氧＋CPA组（0.313±0.021,0.66±0.067）（均P〈0.001）、低氧＋NECA组（0.333±0.019,0.68±0.074）（均P〈0.001）;2、右心室心肌NHE-1 mRNA、CnAβmRNA表达在低氧组均高于常氧组（均P〈0.001）及腺苷处理组低氧＋CPA、低氧＋NECA组（均P〈0.001）。结论腺苷及其受体激动剂可通过NHE-1/CaN信号通路拮抗低氧性右心室心肌肥厚。

肝癌组织中NHE1蛋白的表达及其临床意义

目的:研究人原发性肝癌(hepatocelluar carcinoma,HCC)中的钠氢交换蛋白1(Na+/H+ exchanger1,NHE1)的表达以及与肝癌侵袭转移的关系,进一步探讨其在临床中的意义。方法:用免疫组织化学方法检测人HCC组织、癌旁组织中NHE1蛋白的表达水平,分析人HCC组织中NHE1蛋白的表达情况与临床病理因素之间的相关性。结果:人HCC组织中NHE1蛋白的表达显著高于癌旁组织中NHE1蛋白的表达(t=17.821,P<0.05),其阳性率也显著高于癌旁组织(χ2=42.507,P<0.05)。NHE1蛋白的表达与组织学分级、临床TNM分期以及有无门静脉癌栓密切相关(P<0.05),而与HCC患者的年龄、肿瘤大小、肿瘤个数、血清AFP水平临床病理学指标无关(P>0.05)。结论:NHE1蛋白在人HCC组织中表达水平升高,可能与HCC的恶性程度、疾病的进程以及人HCC的侵袭转移有密切的关系。

善胃Ⅰ号方对胃癌前病变大鼠胃粘膜NHE1蛋白及胃内pH值的影响

目的:通过观察善胃Ⅰ号方对胃癌前病变模型大鼠胃粘膜NHE1蛋白及胃内pH值的影响,从胃内环境角度,探讨该方干预胃癌前病变的作用机制。方法:将80只健康Wistar大鼠随机分为4组,即正常对照组、模型对照组、阳性药物组和善胃Ⅰ号方组,每组20只,造模24周后开始给予药物干预,给药6周后,采用免疫组化法检测大鼠胃粘膜NHE1蛋白的表达水平,高精度酸度计测定大鼠胃液pH值的变化。结果:善胃Ⅰ号方组NHE1蛋白的阳性表达率及胃液pH值较模型对照组及阳性药物组均明显降低(P<0.05)。结论:善胃I号方可能通过抑制胃癌前病变模型大鼠胃粘膜NHE1蛋白的表达,降低胃液pH值,有效维持胃内酸性环境,从而起到干预胃癌前病变发展的作用。

自发性高血压大鼠NHE-1基因表达与左心室肥厚的相关性

目的:探讨自发性高血压大鼠(SHR)NHE-1基因表达与左心室肥厚的相关性。方法:对SHR和同源血压正常大鼠(WKY)进行平均血压、左室重量(LVW)和体重(BW)的测定,同时采用实时定量荧光检测两组大鼠心肌组织中NHE-1mRNA的拷贝数。结果:SHR组与WKY组相比,SHR组的LVW、LVW/BW明显高于WKY组(r左室重=0.700,r左室重体重之比/=0.617,P<0.01),大鼠的平均血压与LVW量、LVW/BW呈正相关(P<0.01);SHR组的心肌组织NHE-1mRNA的表达增高(P<0.01)。结论:SHR的心肌组织NHE-1mRNA的表达增高,提示NHE-1可能参与心肌肥厚的发生、发展过程。

补中益气汤对脾虚泄泻大鼠SGLT1/NHE3通路的影响

目的探讨补中益气汤对脾虚泄泻大鼠SGLT1/NHE3通路的影响。方法采用"大黄+利血平+控制饮食"的多因素法建立脾虚泄泻大鼠模型,连续造模15 d;大鼠随机分为正常组,模型组,补中益气汤低、中、高剂量组(4.67,9.35,18.70 g·kg-1),连续给药15 d;观察并计算大鼠腹泻指数;测定大鼠肠黏膜Na+-K+ATP酶的活性;Western Blot法检测钠依赖性葡萄糖转运体(SGLT1)、葡萄糖转运体2(GLUT2)、钠-氢交换体3(NHE3)、p38MAPK、p-p38MAPK、MAPKAPK2、p-MAPKAPK2、Akt2、p-Akt2、Ezrin、p-Ezrin蛋白的表达。结果与正常组比较,模型组大鼠小肠黏膜Na^+-K^+ATP酶活性显著降低(P<0.01),小肠黏膜中SGLT1、GLUT2、NHE3、p-p38MAPK、p-MAPKAPK2、p-Akt2、p-Ezrin蛋白相对表达量显著降低(P<0.01)。与模型组比较,补中益气汤中、高剂量组大鼠在第25,30天的腹泻指数明显下降(P<0.05,P<0.01),补中益气汤高剂量组大鼠小肠黏膜Na^+-K^+ATP酶活性显著提高(P<0.05),补中益气汤中、高剂量组的SGLT1、GLUT2蛋白相对表达量及补中益气汤高剂量组的NHE3、p-MAPKAPK2、p-Akt2、p-Ezrin蛋白相对表达量显著上调(P<0.05,P<0.01)。结论通过提高SGLT1蛋白的表达,促进p38MAPK/Ezrin通路中蛋白的磷酸化,可能是补中益气汤治疗脾虚泄泻的机理之一。

人肺癌细胞NHE-1基因片段的克隆及其反义表达载体的构建

目的 构建人肺癌细胞Na+/H+交换泵 1(Na+/H+exchanger 1,NHE 1)基因的反义表达载体 ,为将来能在体内应用抑制NHE 1基因表达的肿瘤治疗奠定基础。方法 采用PCR技术从人肺癌A5 49细胞基因组中克隆出长为 45 4bp的NHE 1基因外显子部分序列 ,在上、下游引物的 5’ 端带上BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点。然后将该片段反向插入逆转录病毒载体pLXSN的多克隆位点。最后对产生的重组子进行琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定。结果 经琼脂糖凝胶电泳鉴定 ,所克隆的目的片段大约为 46 7bp ,并成功地连接到pLXSN载体上 ,而DNA测序证实克隆并插入到载体中的片段为目的片段。结论 本实验已成功地克隆了NHE 1的目的片段 ,并将其反向插入到pLXSN中 ,构建了NHE 1反义表达载体pNHE

NHE-1反义RNA对大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡的影响

目的 探讨NHE 1反义RNA对大鼠肺动脉平滑肌细胞 (PASMC)凋亡的影响。方法 构建NHE 1反义RNA逆转录病毒载体 ,转染体外培养的大鼠PASMC ,应用半定量RT PCR法 (sqRT PCR)测定细胞内NHE 1mRNA的表达、BCECF法测定pHi、流式细胞仪测细胞周期、电镜及原位细胞凋亡检测 (TUNEL法 )观察细胞凋亡情况。 结果 转染NHE 1反义RNA逆转录病毒载体的细胞 ,NHE 1mRNA表达量及pHi较空载体转染细胞及未转染细胞显著降低 ,细胞凋亡率显著增加 ,电镜示细胞凋亡 ,凋亡小体形成。结论 抑制NHE 1可通过引起细胞内酸化 ,诱导肺动脉平滑肌细胞凋亡。

NHE-1反义基因磁性纳米颗粒的构建及鉴定

目的 构建NHE 1反义基因磁性纳米颗粒 ,探讨以氧化铁磁性纳米颗粒为载体转染NHE 1反义基因治疗肿瘤的可能性。方法 应用共沉淀法制备外包葡聚糖的氧化铁磁性纳米颗粒(dextrancoatedironoxidenanoparticles ,DCIONP)。使用透射电镜和激光粒度检测仪检测DCIONP的形态和粒径 ,采用琼脂糖凝胶电泳分析氧化铁磁性纳米颗粒结合NHE 1反义基因及抵抗DNaseⅠ消化的能力 ,采用磁场吸引的方法分析氧化铁磁性纳米颗粒携带NHE 1反义基因定向运动的能力。结果 透射电镜观察显示 :纳米颗粒形状不规则 ,颗粒内部有一氧化铁的核心。激光粒度检测仪检测证实DCIONP的平均直径在 4 7nm左右。结合实验的琼脂糖凝胶电泳显示 ,pll DCIONP在各种质量比均有良好的DNA结合能力。DNA保护实验显示从质量比 0 .5∶1开始pll DCIONP能有效保护DNA不被DNaseⅠ降解。沉淀实验证明pll DCIONP可携带质粒DNA在外加磁场作用下在液体中定向移动。结论 成功构建了NHE 1反义基因磁性纳米颗粒 ,该颗粒具有粒径小、稳定性高及磁靶向运动的特点。

NHE1蛋白在胃癌中的表达及与肿瘤侵袭转移的关系

目的探讨NHE1蛋白在胃癌组织中的表达及其与肿瘤侵袭转移的关系。方法采用SP免疫组织化学方法检测NHE1蛋白在40例胃癌中的表达。结果NHE1蛋白在40例胃癌原发灶阳性表达率为82.50%。NHE1蛋白表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移关系密切,而与肿瘤分化程度无关。结论NHE1蛋白在胃癌侵袭转移中起重要作用,对判断预后具有重要意义。