人NHE-1基因反义真核表达载体的构建及初步鉴定

目的 构建人Na+ H+ 交换蛋白 1(Na+ H+ exchanger 1,NHE 1)基因反义真核表达载体。方法 采用分子克隆技术 ,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶从NHE 1cDNApEAP切下所需目的片段 ,然后将该片段反向插入真核表达载体pcDNA3 1( ) Zeo的多克隆位点 ,最后对产生重组子进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果 经琼脂糖凝胶电泳鉴定 ,将目的片段成功的连接到pcDNA3 1( ) Zeo载体上。结论 成功地将NHE 1目的片段反向插入到pcDNA3 1( ) Zeo中 ,构建了人NHE 1反义表达真核载体hNHE 1。

NHE-1核酶基因转染对大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡的影响

目的 探讨NHE 1核酶基因转染对大鼠肺动脉平滑肌细胞 (PASMC)凋亡的影响。方法 构建NHE 1核酶基因逆转录病毒载体 ,转染体外培养的大鼠PASMC ,应用半定量RT PCR法 (sqRT PCR)测定细胞内NHE 1mRNA的表达、BCECF法测定pHi、流式细胞仪测细胞周期、电镜及原位细胞凋亡检测 (TUNEL法 )观察细胞凋亡情况。结果 转染NHE 1核酶基因的细胞 ,NHE 1mRNA表达量及pHi较空载体转染细胞及未转染细胞显著降低 ,细胞凋亡率显著增加 ,电镜示细胞凋亡 ,凋亡小体形成。结论 NHE 1核酶基因转染可通过NHE 1抑制、细胞内酸化 ,显著诱导肺动脉平滑肌细胞凋亡。

人肺癌组织细胞NHE-1 mRNA表达及其意义的研究

目的 :研究人肺癌组织细胞NHE - 1基因表达水平 ;探讨人肺癌细胞在整体条件下PHi调节的分子机制及其生物学意义。方法 :以半定量逆转录PCR研究了 1 4例人肺癌组织手术新鲜标本的NHE - 1mRNA的表达水平。结果 :人肺癌组织细胞NHE - 1mRNA表达水平非常显著地高于正常肺组织 (p <0 0 0 1 ) ,系正常肺组织的 1 1 81倍。结论 :人肺癌组织细胞通过上调NHE - 1基因超表达 ,以增强Na+ /H+ 交换 ,可能是其在整体条件下PHi调节的主要分子机制和特点。

NHE-1与大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡

目的 :探讨Na+ /H+ 交换器 - 1(NHE - 1)、细胞内pH对肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡的作用。方法 :实验分对照组和低氧 3周组 ,大鼠常压低氧 3周后 ,分离肺动脉平滑肌层 ,测定细胞内pH ,并应用RT -PCR技术 ,检测NHE - 1mRNA表达的变化。体外培养肺动脉平滑肌细胞 ,诱导细胞酸化后 ,原位细胞凋亡检测不同浓度及时间NHE - 1特异性抑制剂作用后 ,细胞凋亡率的改变。结果 :低氧组肺动脉平滑肌细胞内pH及NHE - 1mRNA表达均明显高于正常对照组。随药物浓度增加和作用时间延长 ,细胞凋亡率明显增高。结论 :NHE - 1参与调节细胞内pH 。

腺苷通过NHE-1/CaN途径拮抗大鼠低氧性右心室心肌肥厚

目的观察腺苷及其激动剂拮抗右心室肥厚的作用,并探讨其作用机制。方法 56只Sprague-Dawley大鼠随机分成常氧对照组、低氧对照组、低氧处理组（低氧＋腺苷组、低氧＋腺苷A1受体激动剂（CPA）、低氧＋腺苷A2受体激动剂（NECA）、低氧＋CPA＋A1受体阻滞剂（DPCPX）、低氧＋NECA＋A2b受体抑制剂MRS1754组）。大鼠置于低氧仓（氧浓度为9.5%~10.5%）连续低氧21 d。各处理组于低氧第7天使用植入式胶囊渗透压泵给药,持续时间为14 d,实验终点时,测定大鼠右心室肥厚程度,采用PCR法检测右心室心肌组织中NHE-1 mRNA、CnAβmRNA的相对含量。结果 1、慢性低氧对照组大鼠RV/（LV＋S）为0.369±0.033、RV/BW比值为0.75±0.095,均明显高于常氧组（0.271±0.010,0.59±0.039）（均P〈0.001）及低氧腺苷处理组（0.281±0.022,0.650±0.077）（P〈0.001,P=0.025）低氧＋CPA组（0.313±0.021,0.66±0.067）（均P〈0.001）、低氧＋NECA组（0.333±0.019,0.68±0.074）（均P〈0.001）;2、右心室心肌NHE-1 mRNA、CnAβmRNA表达在低氧组均高于常氧组（均P〈0.001）及腺苷处理组低氧＋CPA、低氧＋NECA组（均P〈0.001）。结论腺苷及其受体激动剂可通过NHE-1/CaN信号通路拮抗低氧性右心室心肌肥厚。

自发性高血压大鼠NHE-1基因表达与左心室肥厚的相关性

目的:探讨自发性高血压大鼠(SHR)NHE-1基因表达与左心室肥厚的相关性。方法:对SHR和同源血压正常大鼠(WKY)进行平均血压、左室重量(LVW)和体重(BW)的测定,同时采用实时定量荧光检测两组大鼠心肌组织中NHE-1mRNA的拷贝数。结果:SHR组与WKY组相比,SHR组的LVW、LVW/BW明显高于WKY组(r左室重=0.700,r左室重体重之比/=0.617,P<0.01),大鼠的平均血压与LVW量、LVW/BW呈正相关(P<0.01);SHR组的心肌组织NHE-1mRNA的表达增高(P<0.01)。结论:SHR的心肌组织NHE-1mRNA的表达增高,提示NHE-1可能参与心肌肥厚的发生、发展过程。

Bcl-2、Bax在NHE-1抑制导致的大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡中的作用

目的 :探讨Bcl- 2、Bax蛋白表达在Na+ /H+ 交换器 - 1(NHE - 1)抑制而诱导大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC)凋亡中的作用。方法 :荧光指示剂 (Fura - 2 /AM)测定法检测转染NHE - 1特异性核酶基因的大鼠PASMC内Ca2 + ([Ca2 + ]i)变化 ;RT -PCR方法检测细胞内bcl- 2和baxmRNA表达变化 ,免疫组化法检测细胞内Bcl- 2和Bax蛋白表达变化。结果 :转染NHE - 1特异性核酶基因后 ,大鼠PASMC内 [Ca2 + ]i显著升高 ,bcl- 2mRNA及蛋白表达显著降低 ,baxmRNA和蛋白表达显著增加。结论 :NHE - 1抑制诱导的PASMC凋亡与 [Ca2 + ]i增加、bcl-

针对NHE-1基因的反义核酸诱导人肺癌细胞酸化及凋亡的研究

研究Ｎａ＋／Ｈ＋交换泵（Ｎａ＋／Ｈ＋ｅｘｃｈａｎｇｅｒ，ＮＨＥ）基因家族第一亚型ＮＨＥ－１基因表达在肿瘤细胞内ｐＨ（ｐＨｉ）调节及凋亡调控中的作用。方法：在细胞培养中，以针对ＮＨＥ－１基因的硫代型反义核酸处理人肺腺癌Ａ５４９细胞，采用荧光标记法研究反义核酸对细胞的酸化效应；细胞凋亡原位检测法研究反义核酸诱导细胞凋亡。结果：Ａ５４９细胞酸化效应与ＮＨＥ－１反义核酸呈一定的剂量效应关系，当反义核酸浓度为２０μＭ时，可导致ｐＨｉ下降至６．５５，并诱发细胞凋亡，在处理时间为２４，４８，７２小时，其凋亡发生率分别为３０．１％，９１．２％，９９．６％。结论：①细胞酸化（ｐＨｉ下降至６．５５）能诱发人肺癌细胞凋亡；②人肺癌细胞ＮＨＥ－１基因表达能通过阻止其胞内酸化。

人肺癌细胞NHE-1基因片段的克隆及其反义表达载体的构建

目的 构建人肺癌细胞Na+/H+交换泵 1(Na+/H+exchanger 1,NHE 1)基因的反义表达载体 ,为将来能在体内应用抑制NHE 1基因表达的肿瘤治疗奠定基础。方法 采用PCR技术从人肺癌A5 49细胞基因组中克隆出长为 45 4bp的NHE 1基因外显子部分序列 ,在上、下游引物的 5’ 端带上BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点。然后将该片段反向插入逆转录病毒载体pLXSN的多克隆位点。最后对产生的重组子进行琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定。结果 经琼脂糖凝胶电泳鉴定 ,所克隆的目的片段大约为 46 7bp ,并成功地连接到pLXSN载体上 ,而DNA测序证实克隆并插入到载体中的片段为目的片段。结论 本实验已成功地克隆了NHE 1的目的片段 ,并将其反向插入到pLXSN中 ,构建了NHE 1反义表达载体pNHE

人肺癌细胞NHE-1基因片段的克隆及其反义表达载体的构建

Na^+/H^+交换泵(Na^+/H^+ exchanger,NHE)基因家族有5个亚型,分别命名为NHE-1,2,3,4及β-NHE,其中NHE-l是一种管家基因.NHE-l能通过Na^+/H^+交换,将胞内H^+排出,是维持胞内pH在中性或偏碱性(pH= 7.0～7.2)的一种重要膜蛋白.肿瘤细胞由于其糖酵解的反巴士德效应,导致酸性产物的异常增加,但肿瘤细胞能依靠表达增强的NHE-1膜蛋白,将胞内H^+泵出胞外,阻止癌细胞酸化.而目前已证明胞内H^+的蓄积将会诱发细胞凋亡.因此,抑制人肺癌细胞NHE-1基因上调表达将诱发细胞酸化和凋亡,达到肿瘤治疗的目的.为将来在有机整体中实施NHE-1基因抑制的肿瘤治疗奠定基础,我们从人肺癌组织细胞中克隆了NHE-1基因cDNA的部分序列。

NHE-1反义RNA对大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡的影响

目的 探讨NHE 1反义RNA对大鼠肺动脉平滑肌细胞 (PASMC)凋亡的影响。方法 构建NHE 1反义RNA逆转录病毒载体 ,转染体外培养的大鼠PASMC ,应用半定量RT PCR法 (sqRT PCR)测定细胞内NHE 1mRNA的表达、BCECF法测定pHi、流式细胞仪测细胞周期、电镜及原位细胞凋亡检测 (TUNEL法 )观察细胞凋亡情况。 结果 转染NHE 1反义RNA逆转录病毒载体的细胞 ,NHE 1mRNA表达量及pHi较空载体转染细胞及未转染细胞显著降低 ,细胞凋亡率显著增加 ,电镜示细胞凋亡 ,凋亡小体形成。结论 抑制NHE 1可通过引起细胞内酸化 ,诱导肺动脉平滑肌细胞凋亡。

人肺癌细胞NHE-1基因部分正调控序列的克隆

目的 克隆人肺癌细胞Na+ /H+ 交换泵 1(NHE 1)基因上游正调控序列部分 ,为进一步将该片段导入肺癌细胞株 ,竞争性结合转录因子 ,达到抑制细胞内NHE 1基因的表达奠定基础。方法 采用PCR技术从人肺癌A5 49细胞基因组中扩增长约170bp的NHE 1基因调控序列中起正调控作用的片段。在上、下游引物的 5’ 端带上BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点。然后将该片段连接到pUC18载体上。最后对产生的重组子进行酶切、PCR和测序鉴定。结果 经酶切及PCR鉴定 ,所克隆的目的片段大约为180bp ,而DNA测序证实克隆并插入到载体中的片段为目的片段 ,长度为 168bp ,与报道的序列比较缺失 2个t。结论 本实验已成功地克隆了人肺癌细胞NHE 1基因调控序列中正调控序列片段。

NHE-1反义基因磁性纳米颗粒的构建及鉴定

目的 构建NHE 1反义基因磁性纳米颗粒 ,探讨以氧化铁磁性纳米颗粒为载体转染NHE 1反义基因治疗肿瘤的可能性。方法 应用共沉淀法制备外包葡聚糖的氧化铁磁性纳米颗粒(dextrancoatedironoxidenanoparticles ,DCIONP)。使用透射电镜和激光粒度检测仪检测DCIONP的形态和粒径 ,采用琼脂糖凝胶电泳分析氧化铁磁性纳米颗粒结合NHE 1反义基因及抵抗DNaseⅠ消化的能力 ,采用磁场吸引的方法分析氧化铁磁性纳米颗粒携带NHE 1反义基因定向运动的能力。结果 透射电镜观察显示 :纳米颗粒形状不规则 ,颗粒内部有一氧化铁的核心。激光粒度检测仪检测证实DCIONP的平均直径在 4 7nm左右。结合实验的琼脂糖凝胶电泳显示 ,pll DCIONP在各种质量比均有良好的DNA结合能力。DNA保护实验显示从质量比 0 .5∶1开始pll DCIONP能有效保护DNA不被DNaseⅠ降解。沉淀实验证明pll DCIONP可携带质粒DNA在外加磁场作用下在液体中定向移动。结论 成功构建了NHE 1反义基因磁性纳米颗粒 ,该颗粒具有粒径小、稳定性高及磁靶向运动的特点。

NHE-1基因与心血管疾病

胞膜离子交换蛋白Na’-H^＋交换泵（Na’-H^＋exchanger，NHE）是广泛存在哺乳动物细胞的一种重要跨膜蛋白。是细胞膜上的一种糖蛋白，通常以胞内一个Na^＋．胞外一个H^＋进行电中性的跨膜交换。NHE在体内参与细胞内pH（intracellur PH，pHi）调节、细胞容量的调节、离子转运过程、细胞周期的调节以及细胞增殖过程离子转运等。

NHE-1基因的反义核酸对人肺癌细胞的酸化作用及其意义

目的探讨Na^+／H^+交换系-1（NHE-1）基因在肿瘤细胞内pH（pHi）调节及细胞增殖／死亡中的作用,方法采用荧光探针法检测与NHE-1基因的反义核酸片段（AS-ODN）共孵育后PLA-801D细胞的PHi;用活细胞计数法观察AS-ODN对PLA-801D细胞的毒性作用.结果发现20uMAS-ODN处理24至48小时后即能明显酸化PLA-801D细胞（P＜0.01）,且能显著抑制肿瘤细胞的增殖并导致其死亡。结论NHE-1基因的表达在肿瘤细胞pHi调节及增殖／死亡的调控中起重要作用,抑制其超表达和NHE-1活性有一定的应用价值.

氟伐他汀对心梗家兔左室重构及心肌细胞NHE-1 mRNA表达的影响

目的研究氟伐他汀对正常血脂家兔心梗后左室重构及心肌细胞NHE-1 mRNA表达的影响。方法30只家兔随机分为3组(n=10):假手术组、心肌梗死组和氟伐他汀干预组,干预组予以氟伐他汀10 mg/(kg.d)灌胃给药,心肌梗死组予以蒸馏水灌胃。喂养4周后,进行血流动力学指标、左室肥厚指数(LVHI)的测定,同时运用逆转录聚合酶联反应法(RT-PCR)检测左室非梗死区心肌NHE-1 mRNA的表达。结果心肌梗死组左室重量指数(LVWI)增大、左室收缩压(LVSP)显著降低,而氟伐他汀干预组较心肌梗死组LVSP增高、LVWI下降,NHE-1mRNA表达降低。结论氟伐他汀改善家兔心梗后心室重构,并下调局部心肌NHE-1 mRNA的表达。

NHE-1 miRNA转染所致细胞内pH值变化对BACE1的影响

目的探讨腺病毒介导的人Na+-H+交换体-1(NHE-1)miRNA转染人源性神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y)后,细胞内pH值变化及其对β位淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)的影响。方法培养SH-SY5Y,随机分为正常对照组、NHE-1基因敲低组和阴性对照组,并构建NHE-1基因敲低细胞模型。采用荧光分光光度计测定各组细胞内pH值,通过Real-time PCR及Western blotting检测BACE1 mRNA及蛋白表达。结果与正常对照组相比,NHE-1基因敲低组细胞内pH值明显降低(P<0.01),阴性对照组细胞内pH值无明显变化;NHE-1基因敲低组细胞内BACE1 mRNA表达及蛋白含量明显增高(P<0.01),阴性对照组细胞内BACE1 mRNA表达及蛋白含量无明显变化。结论细胞内pH值降低能够增强BACE1的表达。

Effects of NHE-1 ribozyme gene transfection on apoptosis of rat pulmonary artery smooth muscle cells in vitro

Objective:To investigate the effects of the transfection of NHE-1 ribozyme gene on the apoptosis of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) in vitro. Methods: After NHE-1 ribozyme gene was designed, synthesized and then cloned into plasmid pLXSN, the recombined plasmid was tansfected into cultured rat PASMC. Expression of NHE-1 mRNA was detected with semi-quantitative RT-PCR. Intracellular pH (pHi) was measured by using fluorescence dye BCECF-AM. Cell cycle was measured with aid of flow cytometric DNA analysis. Cell apoptosis was observed with electron microscopy and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labelling (TUNEL) respectively. Results: The NHE-1 mRNA expression level and pHi value were significantly lower in PASMCs transfected with NHE-1 ribozyme gene than those transfected with pLXSN or without transfection. Meanwhile, the apoptosis rate of cells transfected with NHE-1 ribozyme gene was increased significantly. Morphology of cell apoptosis was observed in the cells transfected with NHE-1 ribozyme gene under an electron microscope. Conclusion: The transfection of NHE-1 ribozyme gene induces the apoptosis of PASMCs by inhibiting NHE-1 expression and intracellular acidification.