基于蛋白质组学探讨Ppp3cb和Ppm1g在NHE1基因敲除模型鼠海马组织中的表达

目的通过NHE1基因敲除模型鼠的海马组织差异蛋白质组学分析,发现并明确Ppp3cb和Ppm1g的表达特征。方法①选取6只2周龄NHE1基因敲除模型鼠作为模型组,同周龄野生型小鼠6只作为对照组,采用琼脂糖凝胶电泳检测其基因型;应用旷场实验和强迫游泳实验对模型组和对照组小鼠进行行为学评估,并按照Racine评分标准对模型鼠进行癫痫发作分级;②通过串联质谱分析技术对模型组和对照组的海马组织进行差异蛋白筛选,基因本体论(Gene Ontology Analysis,GO)分析差异蛋白并进行注释和富集,蛋白网络数据库(search tool for the retrieval of interesting genes,STRING)分析差异蛋白之间的蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI);③应用qPCR和Western blot检测Ppp3cb和Ppm1g的转录和翻译水平,应用免疫组织化学技术分别观察其在组织中的表达量。结果①模型组小鼠NHE1基因未见表达,旷场实验中模型鼠的运动总距离较对照组减少(P=0.0073),跨越的格子数比对照组显著减少(P<0.0001)。强迫游泳实验结果显示,模型鼠不动的时间明显延长(P<0.0001);②以表达倍数(FC)≥1.2倍且P<0.05为筛选标准,检测到海马组织中845个差异表达的蛋白质点,其中有9个蛋白表达上调,7个蛋白表达下调。其中Ppp3cb下调,Ppm1g上调。GO功能注释结果表明,NHE1敲除后,分子功能(MF)富集在蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性的差异最显著,细胞成分(CC)富集在质膜部分的差异蛋白数量最多,生物过程(BP)富集在负向调节生物过程、免疫系统过程的差异蛋白数量最多。STRING分析显示差异蛋白Ppp3cb和Slc9a1直接作用,Ppm1g通过Ppp3cb和Slc9a1间接作用,Ppp3cb和Ppm1g之间相互作用。③Ppp3cb的转录和翻译水平减少,在组织中的表达量下降,而Ppm1g转录和翻译水平增加,在组织中的表达量上升(P<0.05)。结论本研究确定了NHE1基因敲除小鼠海马组织中差异蛋白Ppp3cb表达下调,而Ppm1g表达上调,为进一步研究Ppp3cb和Ppm1g参与癫痫发病机制提供了依据。

薯蓣皂苷对缺血性脑损伤模型大鼠cAMP/PKA通路、NHE1和GLUTs蛋白的调控作用

目的探究薯蓣皂苷对缺血性脑损伤模型大鼠环腺苷酸(cAMP)/蛋白激酶(PK)A通路、葡萄糖转运蛋白(GLUTs)、1型Na^(+)/H^(+)交换蛋白(NHE1)的调控作用。方法60只SPF级雄性SD大鼠,随机分为假手术(J)组、模型(MCAO)组、尼莫地平(N)组(15 ml/kg)、薯蓣皂苷高、中、低剂量(H、M、L)组(200、100、50 mg/kg),每组10只,线栓法构建大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)再灌注模型,造模成功后灌胃给药7 d(1次/d)。测定各组大鼠神经功能评分,Western印迹检测脑组织中GLUTs和NHE1蛋白水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测脑脊液cAMP、PKA水平。结果与J组比较,MCAD组神经功能评分显著增高,脑脊液中cAMP、PKA含量显著降低,GLUTs表达水平显著减少,NHE1表达水平显著升高(均P<0.01)。与MCAO显著组相比,H、M、L组能显著改善神经病学症状(P<0.01,P<0.05),显著升高cAMP、PKA含量及GLUTs表达水平,并显著降低NHE1表达水平(P<0.01,P<0.05),其中H组效果最佳,与N组接近。结论薯蓣皂苷可通过上调cAMP/PKA通路,升高GLUTs、降低NHE1水平,来缓解MCAO模型大鼠脑组织缺血缺氧,保护脑组织。

过表达NHE1通过上调钙蛋白酶活性降低RAW264.7细胞ABCA1蛋白表达

目的探讨过表达钠氢交换体1(NHE1)对RAW264.7细胞三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)蛋白表达的影响。方法采用Ad NHE1腺病毒感染RAW264.7细胞,Western blot法检测NHE1-EGFP融合蛋白的表达,激光共聚焦显微镜技术检测NHE1-EGFP融合蛋白细胞内定位,酸负载p H回复检测NHE1活性,Western blot法检测NHE1-EGFP融合蛋白对RAW264.7细胞ABCA1蛋白水平及钙蛋白酶(calpain)活性的影响,加入calpain抑制剂N-乙酰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-正亮氨酸(ALLN),Western blot法检测肝脏X受体激动剂TO-901317诱导ABCA1蛋白表达水平的影响。结果 Ad NHE1腺病毒感染RAW264.7细胞后,高表达NHE1-EGFP融合蛋白,定位在细胞质及细胞膜。NHE1-EGFP融合蛋白可降低ABCA1蛋白的表达水平并提高calpain活性,而calpain抑制剂ALLN能阻断ABCA1蛋白表达水平降低。结论 NHE1过表达通过上调calpain活性而降低ABCA1蛋白表达水平。

NHE1在心肌肥大,心肌纤维化和心衰中的作用

心肌肥大、心肌纤维化是多种慢性心衰的共同病理学改变,钠氢交换体1(NHE1)是多种因子介导的心肌肥大和心肌纤维化的信号转导通路上的共同途径,直接参与了其病理生理学过程,这些因子包括多种生长因子、肾上腺素能受体激动剂、血管紧张素、内皮素、凝血酶以及直接作用于细胞上的机械性张力。从理论推理和实验学证据两方面研究NHE1参与心肌肥大、纤维化和心衰的机制具有重要的意义。

肝癌组织中NHE1蛋白的表达及其临床意义

目的:研究人原发性肝癌(hepatocelluar carcinoma,HCC)中的钠氢交换蛋白1(Na+/H+ exchanger1,NHE1)的表达以及与肝癌侵袭转移的关系,进一步探讨其在临床中的意义。方法:用免疫组织化学方法检测人HCC组织、癌旁组织中NHE1蛋白的表达水平,分析人HCC组织中NHE1蛋白的表达情况与临床病理因素之间的相关性。结果:人HCC组织中NHE1蛋白的表达显著高于癌旁组织中NHE1蛋白的表达(t=17.821,P<0.05),其阳性率也显著高于癌旁组织(χ2=42.507,P<0.05)。NHE1蛋白的表达与组织学分级、临床TNM分期以及有无门静脉癌栓密切相关(P<0.05),而与HCC患者的年龄、肿瘤大小、肿瘤个数、血清AFP水平临床病理学指标无关(P>0.05)。结论:NHE1蛋白在人HCC组织中表达水平升高,可能与HCC的恶性程度、疾病的进程以及人HCC的侵袭转移有密切的关系。

善胃Ⅰ号方对胃癌前病变大鼠胃粘膜NHE1蛋白及胃内pH值的影响

目的:通过观察善胃Ⅰ号方对胃癌前病变模型大鼠胃粘膜NHE1蛋白及胃内pH值的影响,从胃内环境角度,探讨该方干预胃癌前病变的作用机制。方法:将80只健康Wistar大鼠随机分为4组,即正常对照组、模型对照组、阳性药物组和善胃Ⅰ号方组,每组20只,造模24周后开始给予药物干预,给药6周后,采用免疫组化法检测大鼠胃粘膜NHE1蛋白的表达水平,高精度酸度计测定大鼠胃液pH值的变化。结果:善胃Ⅰ号方组NHE1蛋白的阳性表达率及胃液pH值较模型对照组及阳性药物组均明显降低(P<0.05)。结论:善胃I号方可能通过抑制胃癌前病变模型大鼠胃粘膜NHE1蛋白的表达,降低胃液pH值,有效维持胃内酸性环境,从而起到干预胃癌前病变发展的作用。

NHE1蛋白在胃癌中的表达及与肿瘤侵袭转移的关系

目的探讨NHE1蛋白在胃癌组织中的表达及其与肿瘤侵袭转移的关系。方法采用SP免疫组织化学方法检测NHE1蛋白在40例胃癌中的表达。结果NHE1蛋白在40例胃癌原发灶阳性表达率为82.50%。NHE1蛋白表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移关系密切,而与肿瘤分化程度无关。结论NHE1蛋白在胃癌侵袭转移中起重要作用,对判断预后具有重要意义。

抑制NHE1活性对干细胞向心肌分化的影响

Na+/H+交换蛋白1(NHE1)在心肌细胞发育过程中发挥重要的调节功能。为深入探索NHE1活性对干细胞向心肌分化过程中产生的影响,采用二甲基亚砜(DMSO)诱导P19干细胞向心肌细胞分化,同时在培养液中添加NHE1抑制剂EMD87580,对诱导后形成的类胚体进行检测。通过细胞形态观察、免疫组织化学染色及检测心肌特异表达基因等方法证明,经诱导形成的类胚体贴壁生长后,会向心肌细胞分化并出现跳动细胞团。而经过抑制剂处理的P19干细胞尽管能够形成类胚体且贴壁培养后细胞仍具有增殖活力,细胞团周边也较整齐,但未出现向心肌细胞分化的现象。这一结果表明,抑制NHE1的活性,能够影响P19干细胞向心肌细胞的分化作用。

联合抑制人肺腺癌细胞的MCT1基因及NHE1基因表达对其增殖生长的影响

背景与目的:以往的研究中我们发现,用反义基因分别抑制肿瘤细胞膜上的单羧酸转运蛋白第1亚型(monocarboxylatetransporter-1,MCT1)基因和Na+/H+交换蛋白第1亚型(Na+/H+exchanger-1,NHE1)基因的表达,可使肿瘤细胞内pH(intracellularpH,pHi)降低,细胞酸化死亡。而同时抑制这两种基因的表达,对肿瘤细胞pHi及其增殖生长的影响尚不清楚。方法:用电穿孔法将MCT1基因及NHE1基因相应的反义基因表达载体pLXSN-MCT1和pLXSN-NHE1同时转染于人肺腺癌细胞系A549中,经G418筛选阳性克隆,用PCR及RT-PCR方法鉴定MCT1和NHE1的反义基因与A549基因组的整合。pHi及乳酸含量用分光光度法测定;细胞生长周期用流式细胞仪测定;并将联合转染反义基因的细胞、转染MCT1反义基因的细胞、A549细胞分别接种于裸鼠皮下,观察移植瘤的生长。结果:与A549细胞比较,联合转染反义基因的细胞pHi降低、乳酸显著升高(P<0.001),细胞周期阻滞在G0-G1期。接种联合转染反义基因细胞和转染MCT1反义基因细胞的裸鼠移植瘤明显比接种A549细胞的轻且小(P<0.001)。结论:MCT1基因和NHE1基因可能通过影响pHi对肿瘤细胞的增殖生长起重要的调节作用。

NHE1反义基因磁性纳米微粒对胃癌细胞NHE1蛋白表达及裸鼠成瘤力的影响

目的:探讨NHE1反义基因磁性纳米微粒对胃癌细胞NHE1蛋白表达及裸鼠成瘤力的影响,探索胃癌基因治疗新方法。方法:构建NHE1反义基因真核表达载体和NHE1反义基因磁性纳米微粒,将NHE1反义基因转染至SGC-7901胃癌细胞中,通过免疫组织细胞化学SP法检测NHE1蛋白表达情况,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期,观察双层软琼脂集落形成能力及转染前后生长曲线的变化。电镜水平比较观察转染与未转染细胞形态学变化,并观察裸鼠成瘤能力的改变。结果:氧化铁磁性纳米颗粒成功地将NHE1反义基因转染至SGC-7901胃癌细胞中,转染NHE1反义基因的SGC-7901胃癌细胞NHE1蛋白表达降低,细胞生长速度减慢、体外生长增殖能力降低,透射电镜下细胞线粒体数量增多、体积增大,内质网扩张,核偏向一侧,极性增强,裸鼠成瘤能力下降。结论:NHE1反义基因磁性纳米微粒能使SGC-7901胃癌细胞的NHE1蛋白表达明显下调,裸鼠成瘤能力降低,NHE1蛋白在胃癌细胞生长中起重要作用,NHE1基因可能成为基因治疗胃癌的一个理想靶点。

NHE1反义基因磁性纳米微粒对SGC-7901胃癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨NHE1反义基因磁性纳米微粒对SGC-7901胃癌细胞株增殖和凋亡的影响,探索胃癌基因治疗的新方法。方法:构建NHE1反义基因真核表达载体和NHE1反义基因磁性纳米微粒,将NHE1反义基因转染至SGC-7901胃癌细胞中,比较观察细胞转染前后生长曲线、细胞周期和细胞凋亡率的变化。结果:氧化铁磁性纳米颗粒成功地将NHE1反义基因转染至SGC-7901胃癌细胞中。NHE1反义基因能使SGC-7901胃癌细胞生长速度减慢、体外生长增殖能力降低,转染NHE1反义重组质粒的SGC-7901胃癌细胞增殖指数为34.73%,低于SGC-7901细胞的38.95%;NHE1反义基因使SGC-7901胃癌细胞凋亡率增加,转染NHE1反义重组质粒的SGC-7901胃癌细胞凋亡率为11.75%,显著高于SGC-7901胃癌细胞凋亡率(3.85%,P<0.01)。结论:NHE1反义基因磁性纳米微粒能抑制SGC-7901胃癌细胞增殖,诱导细胞凋亡,具有良好的治疗效果,有一定的临床应用前景。

NHE1反义基因对胃癌细胞NHE1蛋白表达及裸鼠成瘤力的影响

目的:探讨人NHE1反义基因转染对SGC-7901胃癌细胞NHE1蛋白表达及裸鼠成瘤力的影响。方法:构建人NHE1反义基因真核表达载体,采用脂质体法将其转染至SGC-7901胃癌细胞中,通过免疫组织细胞化学SP法检测NHE1蛋白表达情况,流式细胞仪检测对细胞增殖和凋亡的影响,从电镜水平比较观察转染与未转染细胞形态学的变化,并观察裸鼠成瘤能力的改变。结果:转染NHE1反义基因的SGC-7901胃癌细胞NHE1蛋白表达降低;细胞增殖能力下降,细胞凋亡率增加;透射电镜下细胞线粒体数量增多、体积增大,内质网扩张,核偏向一侧,极性增强;裸鼠成瘤能力下降。结论:NHE1反义基因能使SGC-7901胃癌细胞的NHE1蛋白表达明显下调,裸鼠成瘤能力降低,NHE1蛋白在胃癌细胞生长中起重要作用。

人NHE1反义基因转染对SGC-7901胃癌细胞形态学的影响

目的探讨反义NHE1基因转染对SGC-7901胃癌细胞形态学的影响及其在肿瘤基因治疗中的价值。方法构建人NHE1基因反义真核表达载体,采用脂质体法将其转染至SGC-7901胃癌细胞中,从光镜、电镜水平比较观察转染与未转染细胞形态学的变化。结果与亲本细胞相比,光镜下反义NHE1基因转染的SGC-7901细胞胞体增大,胞浆丰富,核大小相对一致,核浆比减少,核分裂相减少,异型性减小。透射电镜下细胞线粒体数量增多、体积增大,并可见髓鞘样变,粗面内质网、Golgi较发达,内质网扩张,核偏向一侧,极性增强。结论反义NHE1基因转染能使SGC-7901细胞发生形态学及超微结构的变化,有促进SGC-7901细胞分化的作用。

J亚群禽白血病病毒受体基因NHE1的遗传多态性分析

为发掘J亚群禽白血病病毒（ALV-J）受体基因NHE1潜在的遗传抗性位点,采用PCR技术分段扩增NHE1受体基因序列,并分析其遗传多态性。结果显示,在黄羽肉鸡NHE1基因外显子区域发现了16个SNP突变,分别为c.309G〉C,c.11653C〉T,c.11689G〉A,c.11917C〉T,c.11946C〉T,c.13405C〉A,c.13429T〉C,c.13438T〉C,c.14108A〉C,c.14516A〉G,c.14522G〉A,c.14654C〉T,c.15834G〉A,c.15873G〉A,c.17560C〉Gandc.17770G〉A。进一步分析表明这些SNP突变均为同义c SNP,未引起氨基酸发生改变;在黄羽肉鸡NHE1基因内含子区域发现了SNP和插入/缺失突变,NHE1基因内含子2c.12239~12240和c.13114~13115分别存在AGGGCTGC和TGAAGCC插入突变,内含子11c.17073~17091存在TGTCCTGTGTCCTCCCTGC缺失突变;在ALV-J攻毒后阴性鸡和阳性鸡的NHE1基因外显子区域均发现c.309G〉C、c.11653C〉T、c.13405C〉A、c.13438T〉C、c.14108A〉C和c.14516A〉G6个SNP突变,内含子区域也均发现与黄羽肉鸡相同的插入/缺失突变。研究结果表明,发现的NHE1受体基因遗传变异位点不能作为ALV-J潜在的遗传抗性位点。

人NHE1反义基因转染对SGC-7901胃癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨人NHE1反义基因转染对SGC-7901胃癌细胞株增殖和凋亡的影响,探索胃癌治疗的新方法。方法采用脂质体法将构建好的人NHE1基因反义真核表达载体转染至SGC-7901胃癌细胞中,比较观察细胞转染前后生长曲线、双层软琼脂克隆形成能力、裸鼠成瘤能力以及细胞周期和细胞凋亡率的变化。结果NHE1反义基因能使SGC-7901胃癌细胞生长速度减慢,双层软琼脂集落形成能力、体外生长增殖能力降低,细胞凋亡率增加,裸鼠体内成瘤能力显著降低。结论反义NHE1基因能抑制SGC-7901胃癌细胞增殖,诱导细胞凋亡,具有良好的胃癌治疗效果,提示NHE1基因可成为胃癌治疗的新靶点,具有一定的临床应用前景。

NHE1生物学功能的研究进展

钠氢交换蛋白1(NHE1)是哺乳动物细胞中广泛表达的整合膜蛋白,主要通过交换细胞内的H^(+)与细胞外的Na^(+)进行电中性交换去除质子,调节细胞内的pH。在已知的10种亚型中,NHE1是表达最广泛的亚型,它定位于质膜,参与很多生理过程,如细胞内pH(pHi)、细胞体积稳态和维持细胞骨架结构,并且对细胞生长、增殖、分化、细胞迁移和凋亡等发挥关键作用。Na^(+)/H^(+)交换器NHE1和HCO_(3)^(-)/Cl^(-)交换器AE2偶联作用,共同调节哺乳动物细胞体积减少。在医学方面,对NHE1的研究主要是在癌症、肿瘤细胞、人的心肌梗死及心血管疾病中的调控作用。本文对NHE1调节细胞内pH、细胞体积及细胞骨架组装的分子机制和卵母细胞减数分裂过程相关研究进行综述,以期为NHE1蛋白相关调控机制研究奠定基础。

人NHE1反义基因转染对SGC-7901胃癌细胞恶性表型的逆转作用

目的:探讨NHE1反义基因转染对SGC-7901胃癌细胞恶性表型的逆转作用及其在肿瘤基因治疗中的价值。方法:将构建好的人NHE1反义基因真核表达载体,采用脂质体法将其转染至SGC-7901胃癌细胞中,观察NHE1反义基因转染后SGC-7901胃癌细胞的细胞形态学、NHE1蛋白表达、体外生长增殖特性、双层软琼脂集落形成能力的变化。结果:NHE1反义基因转染的SGC-7901胃癌细胞形态恶性程度降低,NHE1蛋白表达明显减少,双层软琼脂集落形成能力、体外生长增殖能力降低,接触抑制恢复,细胞凋亡率增加。结论:NHE1反义基因转染能使SGC-7901胃癌细胞的NHE1蛋白表达明显下调并逆转其恶性表型,提示NHE1基因可成为肿瘤治疗的新靶点,具有一定的临床应用前景。

生姜对大鼠脑缺血再灌注脑组织NHE1和HIF-1α蛋白水平的影响

目的研究生姜压榨汁对脑缺血再灌注大鼠脑组织缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF1α)蛋白和Na^+/H^+交换蛋白1型(Na^+/H^+exchanger protein 1,NHE1)表达水平的影响。方法通过线栓法构建大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型,造模成功的大鼠随机分为模型组(MCAO)、生姜压榨汁高(H)、中(M)和低(L)剂量组,另设假手术组(CLT)为对照,各组大鼠经灌胃给药5 d,神经功能评分后,病理组织检查大脑病变情况,干湿重法测大脑含水量,免疫荧光法检测NHE1蛋白在脑组织中的表达,Western Blot法研究HIF-1α蛋白和NHE1蛋白水平。结果与CTL组比较,MCAO组大鼠出现明显的神经功能障碍,病理检测结果显示脑组织出现明显的梗死灶,脑组织含水量明显升高,NHE1蛋白和HIF-1α蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。与MCAO组相比,生姜H、M剂量组能明显改善MCAO大鼠神经病学症状,显著缩小脑梗死面积,降低脑组织含水量,并降低NHE1蛋白和HIF-1α蛋白表达水平(P<0.05)。结论生姜对脑缺血再灌注大鼠脑组织可能发挥保护作用。

2-[5-取代苯并咪(噻)唑-2-硫基]-1-(4-取代苯基)乙酮缩氨基胍的合成及NHE1抑制活性

目的设计合成缩氨基胍类化合物并研究其NHE1抑制活性。方法以4-取代苯乙酮(1)为原料,经溴代得α-溴代物(2),再与2-巯基-5-取代苯并咪(噻)唑(3)反应得到2-(5-取代苯并咪(噻)唑-2-硫基)-1-(4-取代苯基)乙酮(4),最后与氨基胍缩合得到目标化合物;以血小板肿胀模型进行初步的体外NHE1抑制活性筛选。结果与结论合成了12个新化合物,其结构经IR、1H-NMR及MS确证。初步的药理试验表明,12个目标化合物均有一定的NHE1抑制活性,其中化合物5b和5h的活性明显优于阳性对照药卡立泊来德。