NHEJ基因保守性缺陷与放射敏感性的关系研究

目的:研究DNA双链断裂非同源性末端连接系统(NHEJ)保守性与敏感性的关系,寻找NHEJ系统基因的关键突变与肿瘤放射敏感性的关系。方法:采用聚合酶链式反应和克隆技术测定CNE、SPC-A1和MCF-7肿瘤细胞株与DNA双链损伤修复有关的NHEJ系统各基因的功能区序列,梯度比较和分析它们的功能区变化,模拟和比较突变产物亲疏水性差异。结果:CNE细胞中,NHEJ系统的终极基因LigaseⅣ存在与放射敏感性相关的突变,其氨基酸替换:313aaHis→Arg、538aaGly→Arg、579aaLys→Arg和585aaAsn→Ser影响产物蛋白结构。结论:在放射敏感性与NHEJ系统基因保守性和功能关系方面,LigaseⅣ的突变影响较大,与肿瘤细胞DNA双链断裂损伤修复能力和肿瘤放疗疗效直接相关。

钙调蛋白小亚基Capn4对依托铂甙诱导的鼻咽癌细胞CNE2 DNA损伤修复NHEJ通路相关蛋白的作用

目的研究钙调蛋白小亚基Capn4对依托铂甙(VP-16)诱导的鼻咽癌细胞CNE2 DNA损伤修复NHEJ通路相关蛋白Ku80及DNApks的作用,以及对裸鼠体内成瘤的影响。方法高内涵分析仪检测空载的CNE2细胞及下调Capn4的CNE2细胞中非同源重组NHEJ修复通路的特异性质粒EJ5-GFP的阳性率;检测空载的CNE2细胞及下调Capn4表达的CNE2细胞在VP16诱导后Ku80的表达;实时荧光定量PCR检测空载的CNE2细胞及下调Capn4表达的CNE2细胞的Ku80转录水平的变化;体内异种移植空载的CNE2细胞及下调Capn4的CNE2细胞后观察VP-16对鼻咽癌肿瘤质量大小的影响及抑瘤率。结果高内涵分析显示下调Capn4的表达能够抑制CNE2细胞DNA损伤后NHEJ修复通路的GFP阳性率(P<0.01);下调Capn4表达后VP16诱导的CNE2细胞NHEJ通路相关蛋白Ku80、DNApks的表达下降(P<0.01);下调Capn4表达能下调裸鼠成瘤后肿瘤的体积与质量(P<0.01)。结论Capn4对NHEJ通路的抑制与通路相关蛋白Ku80、DNApks有关;下调Capn4的表达能够抑制鼻咽癌肿瘤生长、增加鼻咽癌对放化疗的敏感。

RNA干扰猪NHEJ通路修复因子对HR效率的影响

非同源末端连接(nonhomologous end joining,NHEJ)是动物基因组DNA双链断裂(double-strand break,DSB)修复的优选途径,通过与同源重组(homologous recombination,HR)竞争DSB靶点,进而抑制HR的效率。为提高HR效率,本研究针对猪NHEJ通路修复关键因子PNKP、LIG4和NHEJ1的编码序列,设计并合成相应的靶向小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA),组成若干对RNAi(RNA interference)系统,将RNAi系统与报告质粒SSA-GFP reporter、HDR-GFP system和ss ODN-GFP system共转染至猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs),检测敲低上述NHEJ关键修复因子后对HR的影响。RNAi结果显示,针对PNKP、LIG4和NHEJ1设计的si RNA均可显著敲低PNKP、LIG4和NHEJ1基因的表达(P<0.05)。选择干扰效果最好的si RNA与报告载体共转染PFFs,结果表明干扰PNKP基因表达后可显著提高单链退火(single strand annealing,SSA)修复效率、双链或单链DNA介导的同源重组定向修复(homology-directed repair,HDR)效率分别为55.7%、37.4%和73.1%(P<0.05),而干扰LIG4和NHEJ1分别提高双链和单链介导的HDR效率为37.5%和76.9%(P<0.05)。

NHEJ信号通路关键基因mRNA表达与宫颈鳞癌同步放化疗敏感性的关系

探讨NHEJ信号通路关键基因XRCC4,XRCC5,XRCC6,LIG4,PRKDC及DCLRE1C的mRNA表达水平与宫颈鳞癌同步放化疗敏感性的关系。以42例宫颈鳞癌活检样本为研究对象,采用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析上述6个基因的mRNA表达水平,并将检测结果与患者的同步放化疗敏感性进行关联分析。XRCC6 mRNA高表达患者应答率为47.6%,低表达患者应答率为90.5%(P=0.003);其他5个关键基因的mRNA表达水平与患者的应答率无显著性关联;多因素Logistic回归分析显示XRCC6 mRNA表达水平与患者同步放化疗敏感性有显著性关联(P=0.008)。XRCC6 mRNA表达水平与宫颈鳞癌患者同步放化疗敏感性密切相关,可作为评估其临床疗效的分子标志物。

p53基因及NHEJ相关基因表达水平对基因组编辑效率的影响

目的研究CRISPR/Cas9基因组编辑系统在不同细胞中编辑效率的差异及相关的影响因素。方法基于靶向人TCRα链C区(TRAC)基因的CRISPR/Cas9重组载体分别对293T、HEK-293、HeLa、sw480、Jurkat、K562等细胞进行基因组编辑,检测编辑效率的差异。同时检测p53基因在不同细胞中的突变情况,通过RT-qPCR分析参与非同源末端连接(NHEJ)通路的17个主要基因的表达情况。结果流式检测各细胞的转染效率:293T为30.50%,HEK-293为29.30%,Hela为17.70%,SW480为21.90%,Jurkat为13.08%,K562为18.51%。根据克隆测序结果计算出各种细胞中基因组的编辑率:293T为74.70%、HEK-293为68.00%、Hela为13.47%、sw480为32.70%、Jurkat为65.52%、K562为77.18%。测序结果表明293T、Jurkat、K562细胞的p53基因发生了突变,而HEK-293、Hela和SW480的p53基因为野生型。qPCR结果显示,在编辑效率较高的细胞系中,大部分NHEJ相关基因的表达水平也较高,且其表达水平在p53功能异常细胞系中要比在p53功能正常细胞系中的高。结论本研究发现p53的异常程度以及NHEJ相关基因的表达水平与基因组编辑效率存在相关性。

DNA-PKcs在DNA损伤修复中的作用及机制

机体在体内因素如DNA碱基错配、自身不稳定性、机体代谢产生活性氧自由基(ROS)等,体外因素如辐射、化学毒物、药物、病毒和霉菌等作用下,可以造成DNA损伤。DNA损伤有碱基损伤、错配、DNA单链或双链断裂、嘧啶二聚体形成等多种类型。其中,DNA双链断裂(DSB)是一种非常严重的损伤类型。DSB的修复方式主要有两种,分别是同源重组(HR)、非同源末端连接(NHEJ)[1]。

DNA双链断裂修复通路和卵巢癌的关系

卵巢癌发生发展与DNA损伤累积引起的基因不稳定性和细胞行为异常密切相关。DNA双链断裂修复通路中最为重要的是同源重组和非同源末端连接机制以及最近发现的微同源介导的末端修复形式,能够快速准确地修复DNA双链断裂,对维持基因组稳定性起着至关重要的作用,对卵巢癌的基因诊断、基因治疗以及卵巢癌分子水平研究均有重要意义。

钙调蛋白小亚基Capn4对依托铂甙诱导的鼻咽癌细胞CNE2 DNA损伤修复的作用

目的研究钙调蛋白小亚基Capn4对依托铂甙(VP-16)诱导的鼻咽癌细胞CNE2 DNA损伤修复中的作用及可能影响的修复通路。方法构建shRNA下调Capn4表达的CNE2细胞并以Western blot法验证;高内涵检测γ-H2AX在CNE2细胞及下调Capn4表达的CNE2细胞中的平均荧光强度,分析下调Capn4对VP-16诱导的CNE2细胞DNA损伤修复的作用;NHEJ(非同源重组修复)通路特异性的质粒EJ5-GFP用Fugen6 HD转入CNE2细胞及下调Capn4的CNE2细胞,用高内涵仪检测GFP的阳性率,观察下调Canp4对VP-16诱导的鼻咽癌细胞DNA损伤NHEJ修复通路的影响。结果 shRNA确实下调Capn4在鼻咽癌细胞中的表达。2.5μmol/L VP-16处理CNE2^(Vector)细胞和CNE2^(Capn4(-))细胞后6 h和12 h,CNE2^(Capn4(-))的损伤都较空载体的CNE2^(Vector)细胞高;下调Capn4表达对VP-16造成的CNE2细胞DNA损伤修复有抑制作用(P<0.01)。2.5μmol/L VP-16作用后,CNE2^(Capn4(-))细胞与CNE2^(Vector)细胞相比较GFP平均荧光强度明显更低;下调CNE2表达能够抑制DNA损伤后NHEJ通路的修复(P<0.01)。结论在鼻咽癌细胞中下调Capn4的表达能抑制VP-16所致的DNA损伤修复,这种作用可能是通过抑制NHEJ通路实现的。

钙蛋白酶小亚基Capn4在鼻咽癌细胞CNE2中DNA损伤修复的作用

目的研究钙蛋白酶小亚基Capn4对放射所致的鼻咽癌细胞CNE2在DNA损伤修复中的作用及可能影响的修复通路。方法选取鼻咽癌细胞CNE2与293T细胞在37℃、5%CO_2条件下培养,Western blot法检测Capn4在不同细胞中蛋白表达水平;构建sh RNA下调Capn4表达的CNE2细胞并以Western blot法验证;高内涵细胞成像分析仪分析γ-H2AX在放射后的CNE2细胞及下调Capn4表达的CNE2细胞中的平均荧光强度;非同源末端连接(NHEJ)通路特异性的质粒EJ5-GFP用Fugen6 HD转入空载的CNE2细胞及下调Capn4的CNE2细胞,用高内涵细胞成像分析仪检测GFP的阳性率,观察下调Capn4对放射诱导的鼻咽癌细胞DNA损伤NHEJ修复通路的影响。结果 Capn4在鼻咽癌细胞系中表达明显高于正常细胞(P<0.01);sh RNA确实下调Capn4在鼻咽癌细胞中的表达;下调Capn4表达对放射造成的CNE2细胞DNA损伤修复有抑制作用(P<0.01);下调Capn4表达能够抑制CNE2细胞DNA损伤后NHEJ通路的修复(P<0.01)。结论 Capn4在鼻咽癌细胞CNE2中高表达,下调Capn4的表达能抑制放射所致的DNA损伤修复,这种作用可能是通过抑制NHEJ通路实现的。

Ku基因在微生物中的研究进展

ku基因介导的非同源末端连接(NHEJ)途径是DNA双链断裂(DSBs)的一种修复机制,它不依赖于同源重组,且通过与之竞争而削弱同源重组。由于ku基因在生物进化过程中的高度保守性,其功能在很多微生物中已经得到研究,尤其在丝状真菌中,将ku基因敲除,在NHEJ途径缺陷的背景下,同源重组发挥主要作用,基因敲除的频率大为提高,从而方便了对基因功能的研究。

植物DNA双链断裂损伤修复机制研究进展

DNA双链断裂(DSBs)是细胞最严重的损伤形式之一。高等动植物中主要通过非同源末端连接(NHEJ)途径进行DNA双链断裂修复。该途径不依赖DNA同源性,由一些修复因子如:Ku蛋白异二聚体、DNA-PKcs、XRCC4和ligaseⅣ等,将断裂末端直接连接进行修复。综述了植物DNA双链断裂损伤修复的主要途径及其相关基因研究的进展,探讨了植物DNA损伤修复研究中存在的问题与发展方向。

食用菌遗传操作技术与基因功能的研究进展

对适用于不同食用菌遗传转化的筛选标记和转化方法进行了综述,并介绍了食用菌基因功能研究的新进展。

小分子化合物靶向DNA连接酶Ⅳ提高CRISPR/Cas9基因编辑效率的研究进展

基因编辑工具能够在DNA链上制造特定位点双链断裂(Double-strand breaks,DSB)。细胞内具有修复DSB的2种不同途径,即同源重组(HDR)和非同源末端连接(NHEJ)。NHEJ与HDR之间相互竞争,互为替代DNA修复途径。DNA连接酶Ⅳ参与NHEJ途径并发挥重要作用。DNA连接酶Ⅳ抑制剂可以抑制DNA修复通路中NHEJ的效率,同时可以提高HDR的效率。为了优选小分子化合物实现更有效的基因定点插入,综述了SCR7、NU7026、白藜芦醇、L755507这4种不同的小分子化合物在CRISPR/Cas9基因编辑效率上的研究,归纳了这4种小分子化合物在其中发挥的作用,并用生物信息学软件模拟所用小分子化合物与DNA连接酶Ⅳ的对接。在此基础上,对这4种小分子化合物提高基因编辑效率的研究前景进行了展望。

G_1和G_2期细胞对X射线引起双链DNA断裂修复的影响

目的:探讨X射线对G_1和G_2期细胞双链DNA断裂损伤修复的动力学影响。方法:采用3%多聚甲醛或70%乙醇固定受X射线放射细胞的M059J、M059K和Hela,用流式细胞仪分选G_1和G_2期Hela细胞,以脉冲场电泳分析双链DNA断裂修复动力学。结果:乙醇固定不影响X射线放射引起的双链DNA断裂修复动力学,可用于固定Hela细胞G_1和G_2期的分选,且G_2期细胞双链DNA断裂修复速率显著慢于G_1期细胞。结论:G_1和G_2期细胞中的双链DNA断裂可能采用不同的修复方式。G_1期细胞主要采用快速的末端连接修复方式,而G_2期细胞主要采用相对较慢的同源性重组修复方式。

苹果树腐烂病菌高效基因敲除受体菌株ΔVmKu80的构建

为验证苹果树腐烂病菌VmKu80的基因功能,构建高效率基因敲除的受体菌株。通过基因敲除技术获得介导非同源末端连接(NHEJ)途径的VmKu80基因缺失突变体,并对其生长速率、皿内菌落形态、致病力、分生孢子器的形成和基因敲除效率等进行分析。结果表明,该突变体的生长速率、皿内菌落形态、对苹果的致病力和分生孢子器产生等均与03-8菌株无显著差异,且以VmKu80缺失突变体为受体菌株的基因敲除效率是03-8菌株的12倍。说明,VmKu80缺失突变体的获得可以实现苹果树腐烂病菌基因敲除工作的高通量化,有助于苹果树腐烂病菌的基因功能研究。

细胞周期监控点蛋白Rad9与非同源末端连接修复蛋白Ku70的相互作用研究（英文）

Rad9是一种重要的细胞周期监控点调控蛋白.越来越多的证据显示,Rad9也可与多种DNA损伤修复通路中的蛋白质相互作用,并调节其功能,在DNA损伤修复中发挥重要作用.非同源末端连接修复是DNA双链断裂的一条重要修复途径.Ku70、Ku80和DNA依赖的蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)共同组成DNA依赖的蛋白激酶复合物(DNA-PK),在非同源末端修复连接中起重要作用.本研究中,检测到Rad9与Ku70有直接的物理相互作用和功能相互作用.我们在不同的细胞模型中发现,Rad9基因敲除、Rad9蛋白去除或Rad9表达降低会导致非同源末端连接效率明显下降.已有的研究表明,DNA损伤可导致细胞中Ku70与染色质结合增加及DNA-PKcs激酶活性增强.我们的结果显示,与野生小鼠细胞相比,Rad9基因敲除的小鼠细胞中, DNA损伤诱导的上述效应均减弱.综上所述,我们的研究首次报道了Rad9与非同源末端连接修复蛋白Ku70间有相互作用,并提示Rad9可通过调节Ku70/Ku80/DNA-PKcs复合物功能参与非同源末端连接修复.

回文序列诱导突变的机制及人类相关疾病

在原核和真核生物基因组中,含有回文序列的区域高度可变且稳定性差,主要原因是回文序列能形成发卡或十字形二级结构,然后通过滑动错配、单链复性以及非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)等机制导致缺失突变或染色体易位的发生。在人类基因组中,回文序列较普遍存在于基因表达调控的重要作用元件中,它诱导的缺失和易位突变还与男性不育、地中海贫血等多种疾病的发生、发展密切相关。文章综合近几年国内外相关文献,初步阐释回文序列诱导突变的类型和可能机制,及其与人类疾病的关系,为进一步探讨回文序列在基因表达调控、基因突变及人类疾病中的作用及功能等相关研究提供参考。

山羊CSN2基因内含子7靶向的CRISPR-Cas9系统高效切割位点筛选

【目的】使用CRISPR-Cas9系统在山羊CSN2基因座内含子7上筛选出高效的切割位点.【方法】根据"20N+NGG"原则在CSN2内含子7序列中设计了5个sgRNA靶向位点.分别连接具有sgRNA到和Cas9表达框的PX330-P2A-eGFP载体上,通过脂质体转染到实验室保存山羊胎儿成纤维细胞系中,PCR扩增转染阳性的细胞基因组CSN2内含子7序列,连接到Pmd19-T载体中,测序比较不同的sgRNA介导切割产生的突变.【结果】使用5个sgRNA均可以在山羊CSN2基因内含子7上造成有效切割,产生碱基删除或者插入突变.实验设计的5个sgRNA介导的CRISPR-Cas9系统效率均在30.7%以上,效率最高的2号位点(sgRNA2)介导的切割效率达到了61.5%.【结论】研究确定了CRISPR-Cas9系统在山羊CSN2基因内含子7内进行高效切割的sgRNA,为之后在该基因位点进行高效的非同源介导基因敲入奠定了基础.

组蛋白去乙酰化酶抑制剂对DNA双链断裂修复路径的作用

DNA双链断裂(double strand breaks,DSBs)对细胞生存是致命的.细胞内非同源末端连接(NHEJ)、重组修复(HDR)、单链退火修复(SSA)和微同源序列末端连接(MMEJ)等通路可竞争性修复DNA双链断裂损伤.在肿瘤细胞DNA中制造难以修复的基因损伤,诱导肿瘤细胞周期中止、坏死和凋亡是临床放、化疗的主要策略.组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase)作为抗肿瘤治疗的新靶标,其抑制剂(histone deacetylase inhibitors,HDACi)可显著降低肿瘤细胞DSBs修复能力,增强肿瘤细胞的放、化疗敏感性.研究显示,HDACi抑制了肿瘤细胞中具有正确修复倾向的HDR和经典NHEJ通路,具有错误修复倾向的SSA和MMEJ路径也可能牵涉其中.目前,HDACi作用于DSBs修复通路的分子机制已取得较大进展,但仍有许多问题有待阐明.

BRCA1与DSB修复路径取向

乳腺癌易感基因1(BRCA1)是一个肿瘤抑制基因.BRCA1参与DNA末端切除、细胞周期调控以及染色体修饰等来维护基因组的稳定性.有研究表明,它能够促进正确的DNA双链断裂(DSBs)修复,如同源重组修复(HDR)和经典的非同源末端连接(C-NHEJ);而抑制错误性的DSB修复,如单链退火修复(SSA)和非经典的末端连接(A-EJ);其机制是通过与某些DNA修复相关蛋白质的相互作用来引导DSB修复.目前,BRCA1在DSB修复通路中的作用机制尚未完全明确,仍有待进一步的研究.本文主要阐述BRCA1在DSB各修复通路中是如何发挥其引导作用的.