冬箭筈豌豆耐盐基因NHX1克隆及表达分析

为了分析和挖掘更多豆科牧草耐盐基因,选育耐盐品种,本研究通过同源克隆PCR方法从冬箭筈豌豆(Vicia villosa Roth.)cDNA中克隆NHX1基因,并对其进行生物信息分析。结果表明:冬箭筈豌豆NHX1基因CDS序列长度为1641 bp,编码546个氨基酸,为碱性疏水蛋白,与豌豆同源相似度最高;蛋白结构以α螺旋为主,包含10个跨膜结构域;相对定量分析表明NHX1在根、茎、叶组织中均有表达,盐胁迫下叶中表达量最高并在盐胁迫后48 h达到最大值;1300-cYFP-NHX1农杆菌转化烟草亚细胞定位显示其定位于细胞膜,并通过蛋白印迹法验证蛋白表达。冬箭筈豌豆NHX1基因参与盐胁迫响应,在耐盐性强的材料中相对高表达。本研究为豆科牧草耐盐性改良奠定基础。

利用RNAi技术抑制拟南芥NHX1基因家族的表达

采用RNAi抑制NHX1基因家族的表达,并观察其对拟南芥耐盐性和耐旱性的影响.根据从拟南芥(Ara-bidopsis thaliana)cDNA中扩增出编码Na+/H+反向转运蛋白基因AtNHX1长度为210 bp高度保守序列作为RNAi的靶标区,并正反2个方向插入载体pHANNIBAL中,2个片段用intron连接;将RNAi表达框连入具有NPTⅡ筛选标记基因的表达载体pART27中,构建以拟南芥NHX1基因家族为靶标的RNAi载体.采用农杆菌介导的真空渗透法转化拟南芥,得到T0代转基因拟南芥种子.对转基因阳性植株进行RT-PCR检测以及耐盐性和耐旱性分析.结果表明,利用本实验构建的NHX1基因家族RNAi载体,拟南芥NHX1基因家族表达被成功地抑制;耐盐和耐旱分析表明RNAi技术对基因表达沉默是有效的.

农杆菌介导灰绿藜NHX1基因转化新疆大叶苜蓿的研究

利用转基因技术能够快速有效地获得抗盐碱苜蓿的新品种，但苜蓿的品种直接影响着其再生能力和遗传转化，因此建立农杆菌介导的大叶苜蓿转基因体系对于大叶苜蓿抗逆新品种培育具有重要的促进作用。将新疆盐生植物灰绿藜（Chenopodium glaucum Linn．）的Na^＋／H^＋反向运输体基因Cg-NHX1构建在植物表达载体pBIN438上，并转化入根瘤农杆菌EHA105，以5-7d苗龄的新疆大叶紫花苜蓿（Medicago.sativa）子叶为转化受体，通过重组EHA105介导的子叶浸染法将Cg-NHX1基因导入新疆大叶紫花苜蓿中，获得了抗卡那霉素的再生植株。提取转基因植株基因组DNA，进行PCR检测和Southem blot分析，结果表明Cg-NHX1基因已经被整合到新疆大叶紫花苜蓿基因组中。研究成功地获得灰绿藜NHX1基因转化的新疆大叶紫花苜蓿植株，并在新疆大叶紫花苜蓿遗传转化影响因素的研究中，发现茵液浓度OD600nm为0.2-0.3，浸染时间20min适宜于子叶愈伤诱导，有利于基因转化植株的获得。

硅促进盐胁迫下黄瓜NHX1基因表达及Na^+在液泡中的区隔化效应

【目的】硅可提高植物的耐盐性,但不同植物中硅提高耐盐性的机理并不相同。探究硅对盐胁迫下黄瓜幼苗的氧化损伤、Na^+积累和激素水平的影响,以阐明硅提高黄瓜耐盐性的机制。【方法】以基因型为Mch-4的黄瓜幼苗为试材,进行水培试验。营养液中NaCl的胁迫浓度为65 mmol/L,施硅水平为Na2SiO3·9H2O0.3 mmol/L。在处理10天后,测定黄瓜幼苗生物量、Na^+含量与分配、Na^+转运相关基因表达水平及激素含量。【结果】施硅可改善盐胁迫下黄瓜幼苗的生长,减轻植株的氧化损伤。硅对盐胁迫下黄瓜根系和叶片Na^+含量无明显影响,可显著降低根和叶中质膜Na^+/H^+反向转运蛋白基因SOS1的表达量,对高亲和力钾转运蛋白基因HKT1的表达均影响不大,但促进了液泡膜Na^+/H^+反向转运蛋白基因NHX1的表达。对盐胁迫下黄瓜叶片Na^+的亚细胞定位发现,硅处理使叶绿体中Na^+含量下降,而液泡中Na^+含量升高。硅处理提高了盐胁迫植株根和叶片中赤霉素、生长素和细胞分裂素的水平。【结论】施硅可提高液泡膜Na^+/H^+反向转运蛋白基因NHX1的表达,将Na^+区隔化于液泡中,进而降低叶绿体中的Na^+含量,缓解盐胁迫下黄瓜幼苗的氧化损伤;硅还诱导产生了较多的赤霉素、生长素和细胞分裂素,其调控Na^+积累和黄瓜幼苗的氧化损伤的机理还需进一步研究。

根癌农杆菌介导的苜蓿悬浮胚性愈伤遗传转化体系的建立与优化

苜蓿基因型是限制遗传转化的关键因素之一。本实验通过对7种苜蓿胚性愈伤组织诱导,筛选出一份具有高频再生潜力的基因型公农-1号,并以该基因型为转化平台探索和建立了一套高效的苜蓿遗传转化系统。分析了影响农杆菌共培养转化苜蓿悬浮胚性愈伤的因素,优化了悬浮培养条件,建立的超声波辅助农杆菌介导苜蓿胚性愈伤的遗传转化系统为:以下胚轴诱导的愈伤组织经悬浮培养得到的胚性愈伤为转化材料,乙酰丁香酮为100μmol·L-1、超声波处理时间8s、卡那霉素筛选浓度30mg·L-1、共培养4d,接种于选择培养基上进行筛选和再生。最终,获得了大量的转基因植株,分子检测证实目的基因-角碱蓬液泡膜型Na+/H+逆向转运蛋白基因已经整合到苜蓿基因组中。

红海榄液泡膜Na^+/H^+逆向转运蛋白基因的克隆与分析

根据液泡膜Na+/H+反转运蛋白基因(NHX1)的保守序列设计引物,通过RT-PCR扩增得到红海榄Na+/H+反转运蛋白基因的cDNA片段,然后采用cDNA末端快速扩增法(RACE)得到RsNHX1基因的全长cDNA序列,GenBank登录号为FJ627273,被命名为RsNHX1。该基因序列的长度为2 094 bp,包含有1个1 614 bp的开放阅读框,编码538个氨基酸。该基因生物信息学分析表明:其氨基酸序列与胡杨PeNHX1(ABY86892)和拟南芥AtNHX1(AAM34759)基因的同源性分别为74%和69%,序列存在较大差异。