前导肽介导的SprD蛋白体外折叠研究

为提高以前体形式合成的蛋白质折叠与成熟效率,以枯草杆菌蛋白酶SprD为研究对象,通过蛋白重组表达、氨基酸定点突变、包涵体纯化结合体外复性、酶催化性能测定等方法比较各前体蛋白折叠成熟情况。结果表明,野生型前导肽介导的SprD前体蛋白可以在230 min内完成成熟,时间较长;成熟肽序列中E112A、S221A及S221C等突变导致相应前体蛋白成熟时间延长或成熟失败;而前导肽串联表达和切割位点酪氨酸缺失等措施可以将蛋白成熟时间缩短至80~160 min,成熟效率提高0.5~2.0倍,且成熟酶催化能力不受影响。前导肽序列中单个氨基酸位点改变对蛋白成熟影响较小,但对酶催化能力提升有一定帮助。因此,前导肽介导的蛋白成熟与酶催化能力的改变是2个相对独立的过程,前导肽表达方式与切割位点变化是促进蛋白体外成熟的较优方案。研究结果为加速蛋白成熟与蛋白改造提供了可参考方法。

斑点叉尾NK-lysin成熟肽在毕赤酵母中的表达

NK-lysin是毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞产生的具有抗菌作用的多肽,在机体免疫系统中发挥重要作用,被认为是抗生素的理想替代品。NK-lysin的生物学功能主要由其成熟肽(m NK-lysin)决定。本文在已有斑点叉尾(Ictalurus punctatus)NK-lysin成熟肽原核重组表达载体p ET-32a(+)-m NK-lysin的基础上,通过PCR在m NK-lysin的5’端和3’端分别添加EcoRI和Xba I酶切位点,并在3’端添加6×His标签以便于纯化;扩增到的片段与表达载体p PICZαA连接构建重组表达载体p PICZαA-m NK-lysin,转化至毕赤酵母X-33细胞中,通过博来霉素筛选以及对酵母转化子基因组的PCR鉴定得到高拷贝酵母转化子;在29℃,250 rpm,采用0.5%甲醇进行诱导表达;表达产物经固化金属离子亲和层析(IMAC)获得纯化的重组体m NK-lysin。经Tricine-SDS-PAGE分析,其分子量约为11.5 k D;经Western blot分析,证明m NK-lysin在毕赤酵母中成功表达。

兔抗人BMP-2成熟肽抗血清的制备

目的利用在大肠杆菌中表达的人骨形成蛋白-2(hBMP-2)成熟肽,制备兔抗hBMP-2成熟肽抗血清。方法将含有hBMP-2成熟肽基因的表达载体pDH2m,转化大肠杆菌,热诱导表达hBMP-2成熟肽,经纯化、复性后,再用其免疫兔子,制备兔抗hBMP-2成熟肽抗血清。并以Western-blot和免疫组化方法对抗血清进行鉴定。结果Western-blot结果显示在对应于hBMP-2成熟肽位置有阳性条带,免疫组化结果显示人软骨细胞胞浆阳性着色。结论hBMP-2成熟肽在大肠杆菌中获得高表达,并成功制备了兔抗hBMP-2成熟肽抗血清。

Hsp70-H22肿瘤细胞肽复合物与树突状细胞成熟的关系

探讨热休克蛋白 70 (Hsp70 ) - H2 2肽复合物与小鼠骨髓来源的树突状细胞 (dendritic cell,DC)成熟之间的关系。采用 GM- CSF、IL- 4刺激培养小鼠骨髓细胞 ,增殖产生大量 DCs;从 H2 2肝癌细胞中获取肿瘤细胞肽 ,体外与Hsp70进行结合 ,结合产物修饰 DC,通过细胞因子检测试剂盒和流式细胞仪对修饰的 DCs上清液和 DCs膜表面分子进行检测。发现 Hsp70 - H2 2肽复合物修饰的 DCs大量分泌 IL- 12、TNF- α、IL- 1β等细胞因子 ,并且高表达主要组织相容性 类抗原 (MHC 类 )、 CD80、 CD40等分子 ,而单独的 Hsp70或 H2 2肽则不具有此作用。结果提示 :Hsp70 - H2 2肽复合物可诱导 DC成熟 ,这种成熟的

抵抗素成熟肽的制备及其对猪葡萄糖和脂肪代谢的影响

为探讨抵抗素成熟肽对猪葡萄糖和脂肪代谢的影响,将猪抵抗素成熟肽(MR)编码序列克隆至pET-32a(+),在大肠埃希菌中表达重组MR融合蛋白,并用Ni-NTA亲和层析纯化。经肠激酶消化切除融合蛋白,用Ni-NTA分离MR。随后将18头5月龄去势巴马香猪随机分为3个组,对照组肌肉注射生理盐水0.5mL,试验1组和2组分别肌肉注射20ng/kg和40ng/kg的MR,于注射后0、1、2、3、4、5h分别采血,检测血清葡萄糖及脂肪代谢相关指标。结果表明,重组MR融合蛋白分子质量为29ku,切除融合蛋白的MR分子质量为12ku,纯化的MR浓度约3mg/L。给予外源性MR后,试验组猪血清葡萄糖显著高于对照组(P<0.05);脂蛋白酯酶活性亦有升高的趋势,但组间差异不显著(P>0.05);两个试验组猪血清甘油三酯含量均显著降低,试验2组显著低于试验1组和对照组(P<0.05);试验2组猪血清游离脂肪酸含量显著高于试验1组和对照组(P<0.05)。由此可见,抵抗素能抑制组织细胞的葡萄糖摄入,并通过提高脂蛋白酯酶活性促进甘油三酯分解,在调节机体能量代谢与能量平衡中发挥重要作用。

人源Nodal成熟肽的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:表达人Nodal成熟肽,免疫小鼠制备其多克隆抗体。方法:构建原核表达质粒pReceiver-hNodal,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达His6-hNodal融合蛋白,融合蛋白经Ni-NTA树脂亲和纯化后,回收融合蛋白,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。通过间接ELISA、Westernblot和免疫细胞化学染色和间接免疫荧光等方法检测抗体的效价和特异性。结果:在大肠杆菌中高效表达了与预期理论值大小相符的Mr约13 000的人Nodal成熟肽的融合蛋白,通过免疫小鼠制备的多克隆抗体效价高、特异性强。结论:成功制备了抗人Nodal成熟肽多克隆抗体,为进一步深入研究Nodal在肿瘤发生发展过程中的生物学功能奠定了基础。

大熊猫及其近种活化素基因β_A亚基成熟肽序列的克隆分析及其在分类地位上的应用

借鉴互联网中已经克隆到的Activin基因 βA 亚基成熟肽序列 ,设计并合成 1对兼并引物 ,利用PCR技术从大熊猫、小熊猫、马来熊的基因组DNA中直接扩增目的基因片段 ,并分别克隆到大肠杆菌载体pBlueScript+ 当中 ,然后对培养产物进行序列测定。DNA序列分析表明 ,三种物种的Activin基因 βA 亚基成熟肽序列长度均为 35 9bp ,无内含子。基因片段编码一个含有 119个氨基酸残基的肽段。大熊猫、小熊猫、马来熊在该成熟肽核苷酸和氨基酸序列上表现出高度的同源性 ,其中核苷酸同源性为 93.9% ,氨基酸同源性高达 99%以上。此外 ,3种动物的核酸限制性酶切图谱也高度相似。与GenBank中收录的其他物种Activin基因 βA 亚基成熟肽序列相比较 ,显示此片段在处于不同进化程度的物种之间仍具有高度保守性。运用系统发育与进化树软件包PHILIP ,并结合克隆序列对大熊猫、小熊猫、马来熊进化与分类地位进行了探讨。采用不同的统计学分析方法 ,所得到的 3个物种系统发育进化树的拓扑结构完全一致。相比较而言 ,大熊猫与马来熊有着较近的亲缘关系 ,而小熊猫与上述两个物种的亲缘关系相对疏远。结果支持将大熊猫与马来熊归为熊科、而将小熊猫单列成科的学术观点。这是首次以生殖相关的核基因作为研究对象 。

家蚕神经肽基因的筛查及成熟肽的预测

神经肽(neuropeptide)是家蚕Bombyx mori体内重要的调控物质。为了充分理解神经肽对家蚕发育的调控,扩充家蚕神经肽的数量,本研究利用BLAST的tblastn程序结合OpenOffice软件的查找程序,基于其他昆虫和无脊椎动物神经肽的同源性和保守的结构特点,在家蚕基因、理论蛋白质数据库及NCBI中进行全面而系统的基因筛查;并利用各种在线工具对所筛查到基因和理论蛋白质的结构和成熟肽进行预测分析。结果共获得allatostatin-A(AST-A),allatostatin-B(AST-B),allatostatin-C(AST-C),allatropin(AT),ecdysis-triggering hormone(ETH),crustaceancardioactive peptide(CCAP)和FMRFamide等31个神经肽基因家族,包括37个神经肽基因亚家族,共计44个神经肽基因;预测出193个成熟的神经肽,其中73个根据家族同源性预测在C末端发生酰胺化,而6个被预测在N末端发生了环化,9个被预测酪氨酸发生了硫酸化。大部分成熟神经肽都具有明显的家族结构特征,但proctolin,CCAP及CAPA-PK成熟肽结构上与其他昆虫相比有所扩展。结果提示,家蚕神经和内分泌细胞产生了几乎在所有昆虫中具有的神经肽前体;进化过程中大部分成熟神经肽的氨基酸序列在种间产生了差异,但家族特征性基序高度保守。本研究为神经肽功能研究以及神经肽对家蚕发育尤其是蛹期发育调控的研究奠定了基础。

香蕉多酚氧化酶成熟蛋白的原核表达

笔者所在课题组从巴西香蕉中分离到1个PPO基因全长,并进行了原核表达,但结果未表达出目的蛋白。鉴于上述情况,笔者对香蕉PPO全蛋白进行转移肽分析,结果发现其N端含有转移肽,长度为47个氨基酸。切除转移肽并进行香蕉PPO成熟蛋白原核表达,SDS-PAGE电泳检测结果表明,在62 ku处有一条特异的蛋白条带,与预测大小相符;并且进行质谱分析,结果确定重组表达蛋白为香蕉PPO,初步说明转移肽对香蕉PPO体外表达的影响,为进一步研究香蕉PPO功能及在香蕉褐变生理和调控机制中的作用提供理论基础。

芽孢杆菌中性植酸酶基因的原核表达及酶学性质分析

植酸酶作为饲料添加剂能够有效提高动物对饲料中磷的利用率及减少粪便中磷排放对环境的污染,并降低植酸的抗营养作用。为了获得性能稳定的高活性植酸酶,采用PCR扩增芽孢杆菌(Bacillus sp.)中性植酸酶基因phyC(GenBank登录号:FJ986327)的成熟肽编码序列,将其克隆进原核表达载体pET-28a(+),并转化E.coli BL21(DE3)进行表达。在37℃条件下以0.5 mmol/L IPTG诱导4 h能够获得大量包涵体蛋白,在25℃条件下以0.5 mmol/L IPTG诱导6 h有利于可溶性蛋白的获得。利用Ni-NTA亲和层析柱纯化重组植酸酶产物,获得的中性植酸酶的部分酶学特性为:耐热性较好,最适反应温度55℃,在70℃处理10 min可保持20%以上的酶活性;耐酸、碱能力较强,最适pH 6.0～7.0,pH 5.5～9.0时能保持80%以上的酶活性,pH 5.0～10.0时处理60 min仍能保持70%以上的酶活性,在pH 2.0～4.0时能保持40%以上的酶活性。利用构建的切除芽孢杆菌中性植酸酶基因phyC信号肽编码序列的原核表达载体及优化的诱导表达条件,能够在大肠杆菌中高量表达性能稳定的芽孢杆菌中性植酸酶。

分子内分子伴侣机制的研究进展

在原核生物、真核生物及病毒中,一些蛋白质的折叠不符合Anfinsen原则,即依靠自身的氨基酸序列是不够的,还需一段被称为分子内分子伴侣(IMC)的肽段来协助折叠.根据机制不同,IMC可分为两类:第一类IMC引导成熟肽折叠为具有空间结构的蛋白质;第二类IMC协助成熟肽的多聚化而使其获得生物学功能.IMC能提供比分子伴侣更契合的结构,更有效地引导成熟肽折叠,是一种更优的折叠策略.研究IMC分子机制,不仅能够确定IMC上哪些残基的协同作用引导成熟肽折叠,而且可通过改变或修饰其侧链来改造成熟肽,拓展传统的蛋白质工程.

鸡β-防御-素8 cDNA在大肠杆菌中的融合表达

为了评价鸡β-防御素的功能与基因工程化生产的可能性,从已构建的重组载体pGEM-T Easy-gal-8中克隆gal-8成熟肽cDNA,将该cDNA插入原核表达载体pGEX-6P-1中,构建表达质粒pGEX-6P-1-gal-8,然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。挑取阳性克隆菌用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果检测显示,融合表达的GST-gal-8蛋白大小约30 ku,经灰度扫描显示该融合蛋白的表达量占细菌总蛋白的119 mg/L。用固定化的谷胱甘肽亲和层析柱进行蛋白纯化,融合蛋白经Prescission蛋白酶酶切并纯化获得了完整的gal-8成熟多肽。抑菌活性试验显示,表达的gal-8成熟肽对黄色微球菌有一定的抑菌活性。

先天性小耳畸形患者骨形态发生蛋白-5成熟肽基因突变研究

目的:探讨骨形态发生蛋白-5(BMP5)成熟肽基因突变与先天性小耳畸形发病的关系。方法:收集临床确诊的散发先天性小耳畸形患者35例,用Trizol提取外周血白细胞总RNA,利用反转录-聚合酶链反应-单链构象多态性分析(RT-PCR-SSCP)技术进行BMP5成熟肽基因的突变分析,对异常电泳条带的RT-PCR产物进行核苷酸序列测定,明确突变位点和方式。结果:从35例先天性小耳畸形患者中检测到1种错义突变:第213位点发生TTTT→ACAC突变,编码氨基酸改变为苯丙氨酸→组氨酸。结论:检测到的BMP5成熟肽基因突变可能为致病突变,其与先天性小耳畸形发病的关系有待于进一步研究。

鸭IFN-α成熟肽基因的原核表达、复性及其抗病毒活性研究

为获得鸭α-干扰素(DuIFN-α)并研究其生物学功能,将DuIFN-α成熟蛋白基因与原核表达载体pET32a+连接后转化到BL21(DE3)获得工程菌BL2l(DE3)/pET32a+-DuIFN-α,对其表达产物的纯化和复性关键技术及其抗水疱性口炎病毒(VSV)、鸭瘟强毒(DPV)活性进行研究。结果表明:BL2l(DE3)/pET32a+-DuIFN-α经0.4mmol/L IPTG诱导获得高效表达,表达的重组蛋白相对分子质量约37 ku,以包涵体形式存在;重组蛋白经镍金属螯合介质(Ni-MIAC)进行纯化和复性后获得理想效果,其抗VSV活性的比活力达到12 800 U/mg;利用定量PCR检测到15 U/mL的重组DuIFN-α对鸭瘟强毒表现出抑制作用,为重组DuIFN-α的临床应用提供试验数据。

人源性神经营养素-6成熟肽基因融合表达载体的构建及表达产物的纯化

为了得到人源性神经营养素-6(N eurotroph in-6,NT-6)成熟肽片段,本研究以经测序鉴定的人源性NT-6 cDNA为模板,通过聚合酶链式反应(Po lym erase cha in reaction,PCR)扩增得到NT-6蛋白成熟肽编码区基因片段;将该基因克隆到融合表达载体pGEX 1-λT,构建重组原核融合表达质粒pGEX-NT-6;在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropy l-βD-th ioga lactos ide,IPTG)诱导的条件下,观察融合蛋白在大肠杆菌JM 109中的表达情况;利用蛋白回收试剂盒对表达产物进行纯化。结果表明经PCR扩增后,得到一分子量为460 bp左右的片段;含有该片段的重组质粒经电泳及双酶切鉴定表明,所得到的重组质粒即为含有目的片段的pGEX 1-NT-6;与带有pGEX 1-λT质粒的细菌相对照,pGEX 1-NT-6质粒转化的大肠杆菌JM 109,在IPTG诱导下表达了特异性的融合蛋白,该蛋白分子量为41 KD。获得的融合蛋白经凝血酶酶切后,得到了分子量大约为15 KD的NT-6成熟肽。本研究成功构建了人源性NT-6成熟肽编码区基因融合表达载体,并纯化了其表达产物,为研究人源性NT-6的生物学功能奠定了基础。

革胡子鲶生长激素成熟肽cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

[目的]构建革胡子鲶生长激素基因原核表达体系。[方法]采用PCR方法,扩增得到了革胡子鲶生长激素基因成熟肽的cDNA序列,将该序列克隆至原核表达载体pRSET-A,构建重组质粒pRSET-mGH,并在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行表达。[结果]革胡子鲶生长激素成熟肽cDNA序列全长534 bp,编码1个由178个氨基酸残基组成的生长激素成熟肽,分子量为20.28 kDa,等电点为5.93。SDS-PAGE和Western blot分析表明,表达的目的融合蛋白分子量为27.41 kDa,主要以非可溶性的包涵体形式存在于菌体沉淀中。目的融合蛋白的表达量高达细菌沉淀蛋白总量的36.8%。[结论]该研究为革胡子鲶生长激素的产业化开发和应用奠定了基础。

斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)LEAP2成熟肽在大肠杆菌中的融合表达

以斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)肝脏为基因克隆的材料,通过RT-PCR对编码LEAP2成熟肽区域41个氨基酸的cDNA片段(mLEAP2)进行克隆。根据斑点叉尾鮰与其他鱼类、哺乳动物及两栖动物等其他物种LEAP2成熟肽区域氨基酸序列的比对结果,发现存在14个保守的氨基酸残基,其中4个高度保守的半胱氨酸残基位于成熟肽的羧基端区域,在空间上可形成两对二硫键,推测与LEAP2的抗菌活性有关。进一步构建重组表达质粒pET32a-mLEAP2,使mLEAP2基因与携带有6×His-tag标签和肠激酶识别位点的硫氧还蛋白trxA基因融合,转化至大肠杆菌BL21(DE3)后,在25℃下,经0.7 mmol/L IPTG诱导培养16 h后,成功表达了trxA-mLEAP2融合蛋白。Tricine-SDS-PAGE显示,细胞经超声破碎后,上清和沉淀中均含融合蛋白,采用固化金属离子亲和层析(IMAC)对其进行纯化,得到了纯化的融合蛋白。

林麝、马麝及梅花鹿活化素基因β_A亚基成熟肽序列的克隆和分析

活化素 (Activin)对睾丸和卵巢产生多重调节作用 ,对动物的繁育非常关键。本文参考已克隆的其它物种的活化素基因 βA 亚基成熟肽序列 ,设计一对简并引物 ,通过PCR方法从林麝 (Moschusberezovskii)、马麝 (Moschuschrysogaster)和梅花鹿 (Cervusnippon)的基因组DNA中直接扩增目的基因片段。将目的片段分别克隆到pMD1 8 T载体中 ,并进行序列测定。DNA序列测定及分析表明 ,林麝、马麝和梅花鹿的活化素基因 βA 亚基成熟肽序列长 3 45bp ,三物种核苷酸序列同源性在 98%以上 ,氨基酸序列同源性在99%以上 ,核酸限制性酶切图谱也高度相似。将它们与GenBank中已公布的其它物种的活化素序列进行比较 ,发现该片段在不同进化程度的物种间高度保守。这是首次从麝科动物中成功克隆与生殖相关的核基因 。

假蕈状芽孢杆菌34kDa纤溶酶成熟肽基因的原核表达、纯化及活性分析

为进一步探讨全长基因和成熟肽基因的关系,根据已发表的假蕈状芽孢杆菌34 kDa纤溶酶全长基因DNA序列(GenBank FJ463037)和纤溶酶活性位点的位置,设计合成一对引物,扩增得到纤溶酶成熟肽基因G(951 bp编码317个氨基酸),连接pET-28a构建pET-28a-G载体,热激转化大肠杆菌BL21,成功获得pET-28a-G/BL21工程菌。终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达,经SDS-PAGE检测表达在胞内的融合蛋白,融合蛋白表观分子量约为40 kDa,符合所预测的结果。诱导菌体超声破壁后用纤维蛋白平板法检测表达产物具有纤溶酶活性,镍柱亲和层析纯化后的目的产物仍保留纤溶活性。本研究成功得到了34 kDa纤溶酶成熟肽基因活性表达的重组菌。

水牛生长分化因子9成熟肽基因克隆及重组蛋白质和多克隆抗体的制备

为了获得水牛生长分化因子9(Growth differentiation factor 9,GDF9)重组蛋白质和抗GDF9抗体,根据GDF9基因编码区序列(GenBank:FJ529501.1)设计1对引物,用水牛基因组DNA为模板扩增水牛GDF9成熟肽基因序列,并与其他反刍动物的GDF9成熟肽基因序列进行同源性比较。将该序列克隆到表达载体pRSET-A的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点之间以构建重组表达载体,并将重组表达载体转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),转化菌经IPTG诱导表达重组蛋白质。经Ni-NTA凝胶纯化后的重组蛋白质与矿物油佐剂混合免疫新西兰兔制备抗GDF9抗血清,使用ELISA方法检测血清抗体效价,从抗血清中进一步纯化GDF9抗体。结果显示,成功获得了水牛GDF9成熟肽基因序列,该序列在牛和其他反刍动物之间高度同源。成功构建了重组表达载体并转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导后表达了分子量为1.96×104的GDF9重组蛋白质,其最高表达量达到菌体蛋白质总量的30%左右。成功制备了抗GDF9抗血清,血清效价达到1∶51 200,抗血清经纯化后得到了高纯度的GDF9抗体。GDF9重组蛋白质和抗GDF9抗体有望应用于提高羊繁殖性能和促进动物胚胎发育的研究和技术开发。