炎性受体NOD2及NF-κB在痛风性关节炎中的研究进展

痛风是最常见的晶体诱导的自身炎症性关节疾病,当高尿酸血症、血清尿酸盐持续升高导致自身组织中的尿酸盐水平过饱和,导致单钠尿酸盐(monosodium urate, MSU)晶体在关节内和关节周围形成和沉积时就会发生痛风。研究发现,MSU通过激活炎性受体NOD2通路,进而激活NF-κB炎症因子,参与痛风性关节炎的发作。本文就炎性受体NOD2及NF-κB参与痛风性关节炎的过程研究进展综述如下。

NOD2基因P268S突变是中国人克罗恩病的易感基因吗?

本期龙靖华等作者发表的论文，采用聚合酶链反应（PCR）扩增NOD2／CARD15基因12对外显子．纯化后直接测序的方法，研究了我国广东地区48例克罗恩病（CD）患者、50例溃疡性结肠炎（UC）患者和50名健康对照者NOD2基因突变与炎症性肠病（IBD）的相关性，结果发现了一个有意义的现象。CD组NOD2P268S突变率显著高于UC组和健康对照组．且与CD患者的发病年龄、

黄芩总黄酮对金葡菌肺感染模式识别受体TLR2/Nod2及其相关炎性因子表达的影响

目的观察黄芩总黄酮对金葡菌感染后肺脏模式识别受体TLRs和Nods及其相关炎性因子表达的作用,探讨其抗炎药理可能的作用靶点和机制。方法通过构建体外金葡菌感染鼠肺上皮细胞和体内金葡菌急性小鼠肺感染模型,利用RT-PCR技术,通过多种给药形式观察TLR2/Nod2和下游相关炎性因子的mRNA的表达,金葡菌的增殖数量,以探讨其可能的作用靶点和机制。结果黄芩总黄酮不能减少侵入到胞内的活菌数目,但可以下调由于金葡菌侵入导致的TNF-α的大量合成。金葡菌侵入后Nod2表达大幅升高,黄芩总黄酮有明显的抑制作用,并且和TNF-α的变化呈现一定的相关性。TLR2/MyD88的表达无变化。结论黄芩总黄酮的抗炎作用可能与其下调Nod2受体表达进而抑制下游炎性因子表达相关。

NOD2/CARD15基因突变与中国人克罗恩病相关性的研究

背景:近年多项研究证明NOD2/CARD15基因序列的单核苷酸多态性(SNP)与西方白种人克罗恩病(CD)明显相关,其中3个SNP(R702W、G908R和3020insC)与CD的相关性尤为显著。目的:探讨NOD2/CARD15基因SNP与中国人CD发病的相关性及其与CD临床特点的关系。方法:选取临床资料完整的CD患者48例、溃疡性结肠炎(UC)患者和健康对照者各50例,提取人血白细胞基因组DNA,经聚合酶链反应(PCR)扩增NOD2基因全部12对外显子,纯化后直接测序,根据结果分析其突变与CD病变特点的关系。结果:CD组、UC组和健康对照组均未检出3个西方人常见的NOD2/CARD15基因多态性位点。CD组的P268S突变率显著高于UC组和健康对照组(P<0.05)。5例P268S突变的CD患者病变均位于回肠(P<0.01),4例发病年龄≤20岁(P<0.01),且均并发肠腔狭窄(P<0.01)。结论:中国人CD患者中存在NOD2/CARD15基因P268S突变,且与患者的发病年龄、病变部位和并发症相关,有必要对其功能作进一步探讨。

Nod2与克罗恩病相关性研究的进展

Nod2(Card15)及其相关的Nod1(Card4)都属于近年来研究较多的Nod分子家族。Nod蛋白最初被描述为细胞内Caspase和核因子-κB(NF-κB)信号转导通路的活化因子。随着分子生物学和遗传学研究的深入,NOD2(CARD15)基因与克罗恩病(CD)易患体质的关系逐渐明确。与此同时,生物化学研究证实Nod1及Nod2是细菌肽聚糖成分的细胞内识别分子。作者就Nod蛋白介导的细胞内细菌识别与CD的相关性研究作一综述。

NOD2、TNF-α、MMP-9及Caspase-3在胎膜早破发病中的作用及意义

目的探讨胎膜早破患者胎膜组织核苷酸结合寡聚化结构域受体2(NOD2)与基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、活化型Caspase-3蛋白及羊水中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平表达的相关性,为进一步了解胎膜早破的病因学及治疗途径提供新思路。方法选择足月胎膜早破、未足月胎膜早破、正常妊娠晚期妇女各30例,应用免疫组织化学染色法及蛋白印迹技术检测各组胎膜组织NOD2、MMP-9及活化型Caspase-3的蛋白表达部位及水平,ELISA法检测羊水中TNF-α水平,并分析四者表达的相关性。结果胎膜早破组胎膜组织NOD2、MMP-9、活化型Caspase-3表达及羊水TNF-α水平高于正常妊娠晚期组(P<0.05),未足月胎膜早破组NOD2表达及羊水TNF-α水平高于足月胎膜早破组(P<0.05),MMP-9及活化型Caspase-3在足月胎膜早破组胎膜组织中的表达与未足月胎膜早破组相比差异无统计学意义。胎膜组织中NOD2表达水平与羊水TNF-α水平、胎膜组织中MMP-9及活化型Caspase-3的表达呈正相关(均P<0.01)。结论 NOD2、TNF-α、MMP-9、活化型Caspase-3表达水平升高与胎膜早破的发生相关;四者在胎膜早破发病机制中存在关联。

氧化苦参碱对结肠炎模型大鼠结肠黏膜NOD2与TNF-α的影响

目的研究NOD2在实验性大鼠结肠炎发病机制中的作用,探讨氧化苦参碱对实验性大鼠结肠炎的治疗作用及其机制。方法将32只SD大鼠随机分为4组:对照组、模型组、美沙拉嗪组和氧化苦参碱组,每组8只。除对照组外,其余均采用三硝基苯磺酸造模。氧化苦参碱组给予苦参素注射液肌内注射,美沙拉嗪组给予美沙拉嗪纯化水溶液灌胃,模型组肌内注射等体积0.9%氯化钠注射液,共15 d。观察大鼠结肠黏膜大体形态及组织病理评分,并用免疫组织化学法检测大鼠结肠黏膜NOD2蛋白表达,酶联免疫吸附法检测实验大鼠结肠黏膜α肿瘤坏死因子(TNF-α)表达。结果与对照组比较,模型组大鼠结肠黏膜NOD2蛋白、TNF-α表达均显著升高(P<0.01);与模型组比较,美沙拉嗪组、氧化苦参碱组大鼠结肠黏膜NOD2蛋白、TNF-α表达均显著降低(P<0.01,P<0.05)。结论结肠黏膜NOD2蛋白过度表达、TNF-α分泌增多参与了溃疡性结肠炎的发生发展过程,而氧化苦参碱可以通过抑制NOD2蛋白过度表达、降低TNF-α分泌起到减轻结肠黏膜炎症和保护结肠黏膜的作用。

胞壁酰二肽对体外奶牛乳腺上皮细胞生长及胞内NOD2 mRNA表达的影响

【目的】奶牛乳房炎是奶牛养殖业中最为常见,同时也是带来经济损失最为严重的疾病之一,其主要病因是细菌感染。奶牛乳腺的固有免疫是抵抗病原菌入侵的第一道防线。NOD2是机体固有免疫模式识别受体核苷酸结合寡聚域(nucleotide-binding oligomerization domain,NOD)蛋白家族中的重要一员,通过识别其特异性配体胞壁酰二肽(muramyl dipeptide,MDP)——一种广泛存在于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁中的成分,而参与抵抗多种病原菌入侵。奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMEC)除泌乳以外,还是奶牛乳腺的免疫屏障。本试验欲探究MDP对BMEC体外生长状态及胞内NOD2表达量的影响。【方法】选取健康泌乳中期荷斯坦奶牛乳腺腺泡为组织原材料,采用胶原酶Ⅰ消化法结合梯度浓度胰蛋白酶纯化法分离BMEC;使用上皮细胞特异性表达的角蛋白-18(cytokeratin-18,CK-18)及成纤维细胞特异性表达的波形蛋白(Vimentin)抗体,通过免疫荧光技术对纯化后获得的细胞进行鉴定;将BMEC设为6个处理组,分别添加浓度为0(空白对照组)、1、5、10、15及20μg·mL^(-1)的MDP,24 h后显微镜下观察细胞状态,同时提取细胞RNA并反转录为cDNA,采用实时荧光定量PCR方法检测BMEC中NOD2的表达量。【结果】(1)胶原酶Ⅰ消化法结合梯度浓度胰蛋白酶纯化法分离得到的细胞CK-18免疫荧光结果为阳性,而Vimentin反应为阴性;细胞生长状态良好。(2)空白对照组、1、5及10μg·mL^(-1) MDP刺激组的BMEC生长状态良好,无任何肉眼可见变化;15μg·mL^(-1) MDP刺激组可见少量的BMEC脱落;而20μg·mL^(-1)MDP刺激组可见大量BMEC脱落,漂浮,且即使仍贴壁的细胞,其形态也发生了变化。(3)与空白对照组相比,各刺激组细胞NOD2 mRNA的表达量与MDP的刺激浓度呈正相关,即刺激时间为24 h时,随着MDP浓度的增加,BMEC中NOD2受体mRNA的表达量逐渐增加(P<0.05)。【结论】成功获得了纯度较好的BMEC,该细胞生长状态良好,可以用于后续试验;虽然BMEC中NOD2受体mRNA的表达量与MDP的刺激浓度呈正相关,但在保持BMEC生长状态正常的前提下,MDP体外刺激浓度应控制在10μg·mL^(-1)以下。这些结果提示我们:当病原菌入侵乳腺时,BMEC可以通过NOD2受体途径参与免疫防御反应,但这种防御能力受细菌数量或毒力强度的影响。即在一定的细菌数量或毒力范围内,随着细菌数量的增加或毒力的增强,奶牛乳腺的免疫防御反应也增强,进而清除外来病原菌;而当细菌数量或毒力强度超过一定范围时,乳腺组织受到严重损伤,免疫防御屏障也随之崩溃,奶牛乳腺局部甚至全身将呈现出明显的临床症状。

NOD1/NOD2介导的信号通路在小鼠金黄色葡萄球菌性乳腺炎中的作用

为研究NOD1/NOD2介导的信号通路在金黄色葡萄球菌(S.aureus)引发小鼠乳腺炎中的作用,本实验通过人工接种不同剂量的S.aureus复制小鼠乳腺炎模型,利用组织切片法观察小鼠乳腺病理变化,采用荧光定量PCR方法检测乳腺组织中NOD1、NOD2、下游的受体作用蛋白2(RIP2)、核转录因子κB(NF-κB)以及炎性细胞因子TNF-α、IL-6的m RNA转录水平。结果显示,接种S.aureus的小鼠乳腺组织中炎性细胞增多,NOD1、NOD2、RIP2、NF-κB、IL-6、TNF-α的m RNA转录水平比未接种对照组均显著升高(p<0.05),TNF-α、IL-6的m RNA转录水平变化与NOD1/NOD2相一致。以上结果表明NOD1/NOD2受体及其介导的炎性信号通路参与了S.aureus感染小鼠乳腺的免疫反应。

P268S突变型NOD2/CARD15真核表达载体的构建及其体外表达

背景:NOD2/CARD15基因序列单核苷酸多态性(SNP)与欧美人群的克罗恩病(CD)明显相关,其中R702W、G908R和3020insC3个SNP位点与CD的相关性尤为显著。而日本、韩国以及我国香港和浙江地区的研究均未发现上述3个SNP的改变,但最近研究发现了可能与中国人CD相关的P268S突变。目的:构建P268S突变型NOD2/CARD15真核表达载体和体外转染体系,为研究突变型NOD2/CARD15的功能提供实验基础。方法:应用定点诱变技术构建P268S突变型NOD2/CARD15真核表达载体,以阳离子脂质体介导体外转染技术瞬时转染人胚肾细胞HEK293T,以蛋白质印迹法和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HEK293T细胞NOD2/CARD15的表达。结果:经克隆、酶切、测序证实获得P268S突变型NOD2/CARD15基因,突变载体转入HEK293T细胞后,NOD2/CARD15有效表达。结论:成功构建了P268S突变型NOD2/CARD15真核表达载体,阳离子脂质体是人胚肾细胞有效的体外转染体系。

苦参素注射液对TNBS诱导的结肠炎大鼠结肠黏膜NOD2及IL-6的影响

目的:研究NOD2在实验性大鼠结肠炎发病机制中的作用,并探讨苦参素注射液(OMT)对实验性大鼠结肠炎的治疗作用和机制。方法:将40只SD大鼠随机分为4组:正常对照组、模型组、美沙拉嗪组和OMT组,每组10只。正常对照组未行造模,其余3组均采用三硝基苯磺酸(TNBS)造模。OMT组大鼠给予肌肉注射OMT,美沙拉嗪组大鼠给予美沙拉嗪混悬液灌胃,模型组和正常对照组大鼠均以蒸馏水灌胃,观察实验大鼠结肠黏膜大体形态及组织病理评分,并采用免疫组化法检测大鼠结肠黏膜NOD2蛋白表达,ELISA法检测实验大鼠结肠黏膜IL-6的表达。结果:模型组大鼠结肠黏膜NOD2蛋白、IL-6表达较正常对照组明显升高(P<0.01),美沙拉嗪组、OMT组大鼠结肠黏膜NOD2蛋白、IL-6表达较模型组显著降低(P<0.01)。OMT组大鼠结肠黏膜损伤、结肠黏膜病理组织学评分较模型组明显改善。结论:结肠黏膜NOD2蛋白过度表达、IL-6分泌增多参与了溃疡性结肠炎的发生、发展过程,而OMT可以通过抑制NOD2蛋白过度表达、降低IL-6分泌,起到减轻结肠黏膜炎症,保护结肠黏膜的作用。

NOD2基因对舌鳞癌Tca8113细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察NOD2基因对舌鳞癌Tca8113细胞增殖、凋亡的影响。方法:构建NOD2表达载体(NOD2-pEZ-M29)和NOD2-shRNA表达载体,分别转染舌鳞癌Tca8113细胞48 h后,RT-PCR和Western blot法检测NOD2和HBD-2分子及蛋白表达,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡比例。结果:转染NOD2表达载体的Tca8113细胞NOD2和HBD-2表达较对照组显著增高,细胞增殖速度较对照组慢,凋亡较对照组高;转染NOD2-shRNA载体的Tca8113细胞NOD2和HBD-2表达较对照组显著降低,细胞增殖速度较对照组快,凋亡较对照组低。结论:NOD2可促进舌鳞癌细胞凋亡,抑制其增殖。在舌鳞癌细胞中,NOD2与HBD-2的表达呈正相关。

中国汉族人群NOD2、IRGM、ATG16L1和STAT4基因多态性与克罗恩病的相关性研究

背景:克罗恩病(CD)的病因和发病机制尚未完全阐明,近年国外研究发现NOD2、IRGM、ATG16L1、STAT4基因突变与CD相关。目的:分析NOD2、IRGM、ATG16L1、STAT4基因多态性与中国汉族人群CD发病的相关性。方法:连续纳入2007年1月～2010年1月苏州市立医院中国汉族CD患者66例,66名健康体检者作为正常对照,以PCR联合基因测序检测4种基因相应单核苷酸多态性(SNP)位点的基因型,分析各基因型和等位基因频率。结果:CD组和正常对照组NOD2基因rs2066842位点、IRGM基因rs13361189位点、ATG16L1基因rs2241880位点和STAT4基因rs7574865位点基因型和等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律,两组间4种基因相应SNP位点的基因型和等位基因频率差异均无统计学意义。结论:NOD2、IRGM、ATG16L1和STAT4基因多态性与中国汉族人群CD发病不相关。

炎性受体NOD2在心房颤动病人血小板中的表达意义

目的探讨炎性受体NOD2在心房颤动病人血小板中的表达水平及与炎症因子水平之间的关系。方法入选心房颤动病人80例为房颤组,入选同期非房颤病人80例作为正常对照组。采用荧光定量PCR方法检测两组的血小板NOD2受体表达,采用ELISA法检测两组的炎症因子水平,并探讨两者间的相关性。结果相较于正常对照组,房颤组病人的血小板NOD2受体表达以及炎症因子白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)均升高(P <0.05),且血小板NOD2受体表达水平与IL-1β、IL-6、TNF、hs-CRP水平之间呈正相关关系(P <0.05)。结论房颤病人血小板NOD2受体表达升高,且与炎症因子水平呈现相关性,NOD2水平可能对房颤病人急性心肌梗死发生具有预测意义。

NOD1和NOD2介导的信号通路研究进展

NOD样受体是一类新型胞浆内的固有免疫模式识别受体,在自身免疫调节中起重要作用,一旦被激活,这些分子触发细胞内信号通路,导致激活转录反应,最终在一个炎性基因子集上表达。在本文中,我们将专注于NOD1和NOD2在识别和响应细胞内的病原体(包括革兰氏阳性和革兰氏阴性菌)的作用,以及它们在非肽聚糖含有病原体(例如病毒和原生动物寄生虫)的信号应答。

过表达miR-122-5p通过靶向调控NOD2对帕金森病模型细胞损伤的保护作用及其机制

目的探讨微小RNA-122-5p(miR-122-5p)对帕金森病(PD)模型细胞损伤的保护作用及其分子机制。方法体外培养SH-SY5Y细胞,建立MPP+诱导SH-SY5Y细胞PD模型。分为Con组、MPP+组、MPP++miR-NC组、MPP++miR-122-5p组、MPP++si-NC组、MPP++si-NOD2组、MPP++miR-122-5p+pcDNA组、MPP++miR-122-5p+pcDNA-NOD2组。qRT-PCR与Western印迹检测miR-122-5p、核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)2的表达;流式细胞术检测细胞凋亡率。双荧光素酶基因报告法验证NOD2是否为miR-122-5p的靶基因。Western印迹法检测Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤(Bcl)-2的表达;采用化学比色法检测细胞内丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)含量。结果MPP+组SH-SY5Y细胞中miR-122-5p的表达水平明显降低,NOD2 mRNA及蛋白表达水平明显升高(均P<0.001);转染miR-122-5p mimics或si-NOD2后,细胞凋亡率显著降低,MDA含量与Bax表达水平显著降低,GSH含量与Bcl-2表达水平显著升高(均P<0.001);miR-122-5p可负性调控NOD2的表达;NOD2过表达可逆转miR-122-5p过表达对MPP+诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用。结论过表达miR-122-5p通过靶向调控NOD2对PD模型细胞损伤具有保护作用,其机制可能是通过抑制细胞凋亡及增强抗氧化能力而发挥作用。

白花丹参水提取物通过调控NOD2基因表达对高糖诱导小鼠肾脏足细胞损伤的保护作用及其机制研究

目的研究白花丹参水提取物对高糖诱导的小鼠肾脏足细胞MPC5损伤的影响及分子作用机制。方法高糖刺激和白花丹参水提取物处理MPC5细胞,qRT-PCR检测NOD2、podocin和nephrin mRNA表达,Western blot检测NOD2、podocin和nephrin蛋白表达,流式细胞术测定细胞凋亡率。结果NOD2在大多数人糖尿病肾病组织中呈高表达;高糖抑制小鼠足细胞MPC5中podocin和nephrin的表达,促进MPC5细胞凋亡,诱导MPC5细胞中NOD2 mRNA和蛋白的表达;白花丹参水提取物可以促进高糖诱导的MPC5细胞中podocin和nephrin的表达,抑制NOD2基因的表达,抑制高糖诱导的MPC5细胞凋亡,抑制NOD2表达可促进高糖诱导的MPC5细胞中podocin和nephrin的表达,并抑制细胞凋亡;过表达NOD2逆转了白花丹参水提取物对高糖诱导的MPC5细胞损伤的作用。结论白花丹参水提取物可能通过调控NOD2基因表达减轻高糖诱导的小鼠肾脏足细胞MPC5的损伤,抑制细胞凋亡。白花丹参水提取物对糖尿病肾病具有潜在治疗作用。

NOD2/CARD15基因突变与中国人克罗恩病相关性研究

背景NOD2/CARD15基因是人类克罗恩病(Crohn′sdisease,CD)第一个易感基因,既往研究发现P268S可能与中国人CD发病及临床特征相关。目的本研究旨在证实P268S与中国人CD发病及其临床特征的相关性。方法血样来自临床确诊的50例CD患者,60例溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis,UC)患者及100例健康体检者(healthycontrols,HC)。提取人血白细胞基因组DNA,PCR扩增目的片段,PCR-RFLP发现突变位点,DNA测序证实突变位点。结果共有8例CD患者发现有P268S改变,而在UC患者和HC中分别发现2例和3例P268S改变,CD组明显高于UC和HC组(χ2=10.829,P=0.004),而UC组和HC组无明显差异。8例有P268S改变的CD患者临床特征包括病变多位于回肠,发病年龄轻(6例<20岁),常并发肠腔狭窄而需手术治疗,中-重度患者比例高。结论P268S可能是NOD2/CARD15基因中与中国人CD相关的SNP。P268S与CD患者发病年龄、病变部位及并发症及病情严重程度可能相关。

人NOD2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体的构建

人NOD2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体的构建。以人基因组DNA为模板,PCR扩增含有人NOD2基因启动子不同长度的4段序列,利用特定的限制性内切酶位点,以切除启动子的pEGFP-N3作为框架结构,将这4个序列片段进行酶切并插入表达载体pEGFP-N3中,用Vsp I和Pst I双酶切和PCR鉴定重组质粒,再将重组质粒进行DNA序列分析。构建的重组质粒经脂质体LipofectamineTM2000介导转染HTK293T细胞,转染24 h后加入TNF-α持续刺激细胞24 h或不加TNF-α刺激,在倒置荧光显微镜下观察其能否在NOD2基因启动子的调控下表达报告基因绿色荧光蛋白(green fluores-cent proteins,GFP)。结果:pEGFP-N3-NOD2(617 bp)、pEGFP-N3-NOD2(747 bp)、pEGFP-N3-NOD2(1 136 bp)、pEG-FP-N3-NOD2(1 387 bp)分别经酶切鉴定和序列测定证实目的基因已插入重组质粒;细胞转染结果表明,构建的4段重组质粒pEGFP-N3-NOD2(617 bp)、pEGFP-N3-NOD2(747 bp)、pEGFP-N3-NOD2(1 136 bp)、pEGFP-N3-NOD2(1 387 bp)转染的HTK293T均能表达绿色荧光,其中构建pEGFP-N3-NOD2(1 387 bp)重组质粒经TNF-α持续刺后激绿色荧光表达最强。4段不同长度的人NOD2基因启动子绿色荧光蛋白表达载体成功构建,这为进一步研究NOD2基因表达及调控机制奠定了良好的基础。

从黄芩苷对TLRs-NOD2的调控探讨肺、脑相关炎性反应的共同机制

目的:通过研究黄芩苷对脑缺血和肺炎模型中TLRs-NOD2受体的影响,探讨肺、脑相关炎性病变的共同机制。方法:分别建立小鼠脑缺血再灌和急性肺炎模型,造模后对小鼠腹腔注射黄芩苷,检测小鼠脑和肺组织中TLR2/4、NOD2和TNFα蛋白的表达。结果:脑损伤模型小鼠脑组织和肺组织中,TLR2/4、NOD2和TNFα显著高表达,黄芩苷能够不同程度的下调这些因子;肺炎模型小鼠脑组织和肺组织中,TLR2/4、NOD2和TNFα不同程度的高表达,黄芩苷可以在不同程度上抑制这些因子。结论:黄芩苷对TLR2/4、NOD2受体及下游炎性因子TNFα存在着显著的调控作用,这种调控作用及对炎性反应的影响可能是其对肺、脑病变作用的共同基础。