一个新硝基还原酶基因NOR1编码区单核苷酸多态及与鼻咽癌的关联分析

NOR1基因是中南大学湘雅医学院肿瘤研究所克隆的一个鼻咽癌表达下调新基因 ,生物信息学预测NOR1基因含有硝基还原酶结构域 ,该基因可能参与亚硝胺类化学致癌物在体内的代谢过程 ,从而与鼻咽癌的发生密切相关 .通过采用病例 对照的研究方法 ,利用测序技术对 144名鼻咽癌患者和匹配的 144名正常人NOR1基因编码区单核苷酸多态 (codingregionsinglenucleotidepolymorphisms ,cSNPs)进行基因分型 ,关联分析结果显示所检测到的两个cSNPs之间存在连锁不平衡 ,且均与鼻咽癌发病相关 ,两个cSNPs及它们所组成的单倍型相对危险度分别为 1 3 6、 1 64和 1 3 7.两个cSNPs的多态性改变均使NOR1基因编码蛋白一级结构发生了变化 ,这种改变可能影响NOR1基因编码蛋白的结构和功能 .

敲除NOR1基因对人肝癌裸鼠移植瘤的影响及作用机制

目的 探究敲除NOR1基因后对人肝癌裸鼠移植瘤生长、存活率及器官损伤的影响。 方法 SPF级雄性BALB/C裸鼠30 只随机分为Control组(n=10)、Scramble组(n=10)、siNOR1组(n=10),构建阴性对照质粒 (Scramble)和 siNOR1质粒转染至HepG2细胞并接种至裸鼠构建移植瘤裸鼠模型。连续30 d每5 d检测裸鼠移植瘤组织体积;检测移植瘤重量;免疫组化检测Ki-67、Caspase-3、Notch、NOR1表达情况;Western Blot检测Survivin、Notch1、NICD、Hes1、Hey1蛋白表达量情况,HE染色观察肝、肾、肺、脑病理损伤程度。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验;生存分析采用Kaplan-Meier法,生存率的比较采用log-rank检验法。结果 从建模第20天开始,与Control组相比,siNOR1组第20、25、30 天移植瘤体积显著减小[(418.71±78.24)mm3 vs (149.6.16±60.05)mm3、(864.22±125.66)mm3 vs (239.83±100.51)mm3、(1468.45±199.78) mm3 vs (446.54±147.09) mm3,P值均<0.05];第30天时取出移植瘤,与Control组相比,siNOR1组移植瘤质量显著减小[(0.45±0.07)g vs (0.12±0.04)g,P<0.05];与Control组相比,siNOR1组移植瘤组织中Ki-67、Notch、NOR1阳性表达率显著降低[Ki-67:(48.98±9.75)% vs (11.51±5.09)%, Notch: (62.51±9.26)% vs (18.75±4.61)%,NOR1:(76.33±8.31)% vs (16.57±3.76)%, P值均<0.05],Caspase-3阳性表达率显著升高[(6.39±4.67)% vs (38.03±9.28)%, P<0.05];siNOR1组模型裸鼠30 d内生存率显著高于Control组[(77.66±6.75)% vs (25.32±4.63)%,χ^2=6.897,P<0.05];Western Blot检测结果显示,与Control组相比,siNOR1组Survivin、Notch1、NICD、Hes1、Hey1蛋白表达水平均显著降低(Survivin: 0.34±0.06 vs 0.02±0.01;Notch1:0.16±0.03 vs 0.03±0.01;NICD:0.26±0.05 vs 0.04±0.02;Hes1:0.35±0.04 vs 0.06±0.02;Hey: 0.29±0.06 vs 0.05±0.02,P值均<0.05),且siNOR1组裸鼠各组织器官损伤情况均得到有效缓解。结论 敲除NOR1基因抑制人肝癌裸鼠移植瘤的生长,提高模型裸鼠生存率,并缓解模型裸鼠肝、肾、肺、脑损伤,其机制可能与抑制Notch信号通路活性有关。

NOR1基因对HepG2细胞E-选择素的影响

目的:探讨NOR1基因对HepG2细胞E-选择素的影响。方法:将NOR1基因通过脂质体转染HepG2细胞后,抽提细胞总RNA,采用RT-PCR法检测HepG2细胞中NOR1基因和E-选择素mRNA的表达水平;ELISA法检测细胞培养上清液中E-选择素的蛋白表达水平。结果:RT-PCR结果显示,转染NOR1基因组E-选择素mRNA的表达水平明显高于空白组和对照组的E-选择素mRNA的表达水平(P<0.01)。ELISA结果显示,转染NOR1基因组E-选择素蛋白水平明显高于空白组和对照组(P<0.01)。结论:NOR1基因可诱导HepG2细胞中E-选择素表达水平的增高。

新基因NOR1对肝癌细胞系HepG2蛋白质表达谱的影响

目的:研究NOR1基因对肝癌细胞系HepG2蛋白质表达谱的影响。方法:将pcDNA3.1(+)/NOR1的表达质粒经脂质体导入HepG2细胞,Northern blot筛选出阳性克隆,通过双向电泳分离过表达NOR1的HepG2细胞内蛋白质,筛选出差异表达的蛋白质点,并进行质谱分析鉴定。结果:鉴定出6种表达上调的蛋白质点,包括锌指蛋白、肿瘤坏死因子受体、酪氨酸蛋白磷酸化受体等,这些蛋白质涉及基因转录、信号转导等肿瘤发生相关事件。结论:NOR1基因可能通过上调这些蛋白参与多种途径影响肝癌的发生发展。

新克隆的基因NOR_1对鼻咽癌细胞株HNE_1细胞生长的影响

NOR1是与鼻咽癌密切相关的抑瘤/易感基因候选者之一,将NOR1基因的全长cDNA片段亚克隆至pcDNA3.1(+)的表达载体中,通过脂质体介导转染入鼻咽癌细胞系HNE1,RT-PCR、RNA印迹方法筛选高效表达NOR1的细胞株,并借助细胞生长曲线、软琼脂生长集落形成大小试验、流式细胞仪对转染细胞的生物学行为进行检测.结果发现转染了NOR1基因的HNE1细胞生长速度明显减慢,在软琼脂中的集落形成较对照组明显减小.流式细胞仪分析表明,NOR1可以延缓细胞由G0/G1期进入S期.结果表明NOR1基因可能在抑制鼻咽癌的发生发展中起重要作用,为进一步研究NOR1的功能研究打下基础.

新克隆的硝基还原酶基因NOR_1的表达及其产物的纯化

背景与目的:NOR1是与鼻咽癌密切相关的抑瘤/易感基因候选者之一,本实验旨在构建NOR1基因原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化NOR1基因所编码的蛋白。方法:抽提人鼻咽正常组织中总RNA,利用RT-PCR扩增NOR1基因全长,经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切后插入同样经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切后的pGEX-4T-2质粒,构建表达载体pGEX-4T-2/NOR1重组表达质粒;转化大肠杆菌Jm105,用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(isopropyl-thiogalactoside,IPTG)诱导pGEX-4T-2/NOR1/Jm105表达GST融合蛋白后,采用Westernblot验证,并用GST琼脂糖亲和层析柱对目的蛋白进行纯化。结果:酶切鉴定和测序验证成功地构建了NOR1基因原核表达载体,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulphatepolyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE)分析在大肠杆菌Jm105中成功诱导表达了一分子质量约为74kDa的融合蛋白;该融合蛋白存在于细菌裂解液的上清和沉淀中,Westernblot证实表达获得了成功;并利用亲和层析法获得了纯化蛋白。结论:成功获得了高效表达NOR1基因的原核表达产物,通过对该融合蛋白的纯化为它的多抗制备奠定了基础。

NOR_1基因对HepG2细胞白介素-8水平的影响

目的探讨NOR1基因对HepG2细胞IL-8水平的影响。方法将NOR1基因通过脂质体转染入HepG2细胞后,抽提细胞总RNA,运用RT-PCR检测IL-8mRNA的水平,用ELISA检测细胞培养上清液IL-8的表达水平。结果细胞培养上清液IL-8蛋白水平,转染NOR1基因组明显高于空白组和对照组(P<0.01);而转染NOR1基因组与转染空质粒组IL-8mRNA的表达水平无显著差异(P>0.05);结论NOR1基因诱导HepG2细胞IL-8蛋白水平表达增高。

NOR_1基因对HepG_2细胞E-选择素的影响及机制探讨

目的探讨NOR1基因对HepG2细胞E-选择素表达水平的影响及NF-kB通路是否参与了NOR1基因对HepG2的E-选择素的影响。方法将NOR1基因通过脂质体转染入HepG2细胞。分别设立HepG2细胞对照组、HepG2/pcDNA3.1(+)空白质粒细胞组、HepG2/pcDNA3.1(+)/NOR1转染阳性克隆细胞组、PDTC处理的HepG2/pcDNA3.1(+)/NOR1转染阳性克隆细胞组(后简称PDTC处理组),分别检测4组细胞E-选择素的mRNA水平和蛋白水平。结果基因芯片筛选转染NOR1基因的HepG2细胞E-选择素表达水平上调(cy3/cy5>2.0);RT-PCR结果显示转染阳性克隆细胞组E-选择素mRNA的表达水平明显高于空白组、对照组和PDTC处理组(P<0.01),ELISA结果显示转染阳性克隆细胞组E-选择素表达水平明显高于空白组、对照组和PDTC处理组(P<0.01)。结论NOR1基因诱导HepG2细胞E-选择素表达水平增高,NF-kB通路参与了NOR1基因对HepG2细胞E-选择素的影响。

耐热耐贮番茄品种改良

利用Lima品种作为父本与冬季栽培的番茄品种 (413、4 5 2、4 99、5 14和 5 6 0 )进行杂交 ,改良冬季栽培番茄品种的产量和品质 ,通过对杂交后代自交纯化 ,获得 4 5 2×Lima自交系产量最高 ,为 4 4 .2 9t·hm-2 ,比对照Lima和VF134 1 2增产 33.0 %和 31.6 % ,大部分自交系的果实硬度与对照相同 ;将耐热品种 6 6 7(CL5 915 2 0 6D4 2 5 0 )和 6 6 9(CL5 915 2 2 3D4 2 1 0 )与耐热的冬季栽培番茄品种进行杂交 ,然后自交并对其自交系的耐热性和果实品质进行选择 ,其中 5 0 2× 6 6 9、5 74× 6 6 7的自交系产量分别为 6 9.16和 6 6 .16t·hm-2 ,比对照Lima和VF134 1 2增产 18.2 %和 38.7% ,果实硬度与对照相同 ;将耐热品种L2 2和含突变基因 (nor1、nor2 )材料进行杂交和回交 ,对L2 2的货架期进行改良 ,其中BC2 和BC3 产量比L2 2高 4 %～ 9% ,果实在室温下保存 30d ,其完好率为 18%～ 38% ,而L2 2的果实完好率则为 0。

NOR_1基因真核表达载体的构建及其对肝癌细胞生长的影响

目的NOR1基因真核表达载体pcDNA3.1(+)的构建并了解其对肝癌细胞系HepG2生长的影响。方法将NOR1cDNA亚克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体上,并把重组质粒pcDNA3.1(+)/NOR1经脂质体转染至HepG2细胞中,运用MTT法、台盼蓝排斥等试验、流式细胞仪等分析NOR1基因对肝癌细胞HepG2生物学活性的影响。结果成功构建了NOR1基因真核表达体pcDNA3.1(+)/NOR1,经pcDNA3.1(+)/NOR1转染后的HepG2细胞生长速度明显抑制(P<0.05),且细胞从G0/G1期进入S期明显延缓。结论重组质粒pcDNA3.1(+)/NOR1能在HepG2细胞内表达,且能影响HepG2细胞的生长。