SYBR荧光实时定量PCR检测子宫颈鳞癌组织NRDR及其选择性剪接亚型mRNA表达

目的检测子宫颈鳞癌组织中辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶[NADP(H)-dependent retinol dehydrogenase/reductase,NRDR]及其选择性剪接亚型NRDRB1 mRNA的表达,建立SYBR实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)检测NRDR及其选择性剪接亚型mRNA的方法,为准确、快速分析NRDR、NRDRB1基因表达奠定基础。方法根据子宫颈鳞癌组织中NRDR、NRDRB1基因序列,设计并合成引物,将逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增的基因片段克隆至pGEM-T easy载体,重组质粒经蓝白筛选、酶切、测序鉴定后,作为阳性克隆标准品,用于标准曲线的制备,由此可定量检测出每一样品模板中NRDR、NRDRB1起始拷贝数。结果阳性克隆标准品制作的标准曲线可显示循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系(NRDR:r=0.994,NRDRB1:r=0.997),可用于NRDR及其选择性剪接亚型基因表达的起始拷贝数定量测定。结论 RQ-PCR方法较常规PCR技术更为准确、特异、灵敏,对定量检测及研究NRDR及其选择性剪接亚型表达有积极意义。

宫颈癌细胞中NRDR选择性剪接新亚型表达质粒的构建及原核表达

背景与目的：构建宫颈癌细胞中视黄醇脱氢／还原酶．辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢／还原酶（NRDR）及其选择性剪接亚型NRDRB1原核表达载体，并在BL21-AI大肠杆菌中表达融合蛋白。材料与方法：用RT-PCR检测宫颈癌组织中NRDR、NRDRB1表达，RACE方法克隆NRDRB1全长eDNA，运用Gateway表达系统将NRDR、NRDRB1编码区序列构建到表达载体，转化到大肠杆菌中表达，表达的融合蛋白通过金属离子亲和层析纯化。结果：在宫颈鳞癌组织中发现NRDR新的选择性剪接亚型NRDRBl，构建了NRDR、NRDRBl原核表达载体，在BL21-AI中表达出氨基端含6×His标签的重组蛋白，诱导表达4h后目的蛋白可占总蛋白量的30％．50％，经一步亲和层析得到了高纯度的NRDR及NRDRB1重组蛋白。结论：在大肠杆菌中获得高效表达的NRDR、NRDRB1蛋白，为进一步研究其功能提供了实验材料。

一种人肝辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢酶剪接体cDNA的克隆及特征分析(英文)

在用RT PCR法局部扩增人与小鼠肝脏 6 35bp的NRDRDNA时 ,在人肝中发现了另一短序列PCR产物 ,克隆后测序显示其整个序列与NRDRcDNA编码区的前后序列完全一致。采用 3′ Race和 5′ Race方法 ,从人肝组织细胞中扩增得到两个全长cDNA ,除 12 6 1bp的NRDRcDNA外 ,另一个为全长 10 0 3bp、编码区长为 5 2 5bp的NRDRiso(GenBank登录号 :AY0 7185 6 )。数据库分析表明 ,NRDRiso编码区是由人NRDR 8个外显子中的第 1、2、3、7、8外显子选择性剪接而成。缺失的NRDR第 4、5、6外显子共 2 5 8bp ,编码 86个氨基酸。因此 ,与人NRDR的 2 6 0个氨基酸残基相比 ,NRDRiso由 174个氨基酸残基组成 ,分子量为 18 6kDa ,并且NRDRiso的组织表达与NRDR明显不同。

一种新的短链脱氢/还原酶家族新成员:NADP(H)-依赖的视黄醇脱氢酶基因的克隆和分析

从牛的肝脏中快速抽提总RNA ,根据GenBank已发表NADP(H) 依赖的视黄醇脱氢酶基因 (NRDR)的cDNA序列 ,设计并合成特异引物 ,利用cDNA末端快速扩增 (RACE)方法和反转录 聚合酶链式反应 (RT PCR) ,得到牛肝内的NRDRcDNA的全长序列。经测序证实 ,牛肝NRDR的全长cDNA序列为 12 6 6bp ,其开放读码框架在 2 4～ 80 6bp ,编码 2 6 0个氨基酸 (GenBank登录号 :AF4 874 5 4 )。根据NRDR基因推导出的氨基酸序列与人、鼠、兔有高度同源性 ,并含有SDR超家族成员的两个高度保守的模序 ,在其C 端含有过氧化物酶体的靶向序列为SHL。结果表明 ,牛的NRDR应属于过氧化物酶体内SDR超家族成员并在维甲酸合成的限速步骤起作用的酶 ,也为维甲酸合成的传统通路提供一个补充。

一种从动物组织中提取高质量总RNA的方法

RNA提取技术是分子生物学研究中经常应用的最重要的实验技术.简要介绍了一种高纯度、高产量的从动物组织中提取总RNA的方法.该方法具有实用性强、重复性好的特点.提取的RNA无DNA等污染物,并且其产量、纯度完全能满足分子克隆和基因表达研究的需要.利用此方法提取牛组织的总RNA,进行了NRDR基因在牛组织中的表达分布研究.

牛肝辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢酶cDNA的克隆及组织表达

NADP(H) dependent retinol dehydrogenase/reductase (NRDR) was an important retinoic acid synthase, which was first purified from rabbit liver in 1997. In order to study the function of the NRDR gene,the full length cDNA of bovine NRDR was cloned. According to the conserved sequences of human, mouse and rabbit NRDR cDNA, a pair of primers was designed to amplify a 294 bp DNA fragment of bovine liver NRDR, and then the full length of NRDR cDNA (AF487454) was cloned by using 3′ RACE and 5′ RACE. All the cloned NRDR proteins consist of 260 amino acid residues and showed high identity among them. The tri peptide of human, mouse and rabbit NRDR C end was SRL and that of bovine NRDR C end was SHL, but both were considered to be peroxisomal target signal 1 (PTS1). RT PCR demonstrated that NRDR gene was expressed in liver, heart, lung, kidney, stomach and intestine, and was not found in pancreas, muscle, artery and skin. The full length bovine NRDR cDNA has been successfully cloned and the sequence was analyzed. It provided a reliable foundation to investigate the biological function of this protein.

抗兔辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶单克隆抗体的制备和鉴定

背景与目的:制备抗兔辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶[NADP(H)-dependent retinol dehydrogenase/reductase,NRDR]的单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性。材料与方法:以基因工程重组兔NRDR为抗原免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤技术建立稳定分泌兔NRDRmAb的细胞株。以间接ELISA法筛选阳性克隆、鉴定Ig亚类、细胞培养上清及腹水效价,同时采用Westernblot方法检测mAb的特异性。结果:获得3株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞(NR1、NR2和NR5)。其抗体亚类均为IgG1,细胞培养上清效价依次为1∶20、1∶40和1∶20,腹水效价分别为1∶106、1∶107和1∶106。Westernblot结果显示NR1、NR2和NR5抗体均能有效识别兔肝组织中的NRDR及重组表达的兔NRDR。结论:成功地建立了稳定分泌兔NRDRmAb的杂交瘤细胞株,为NRDR生物学功能的进一步研究打下了基础。