nRT-PCR法检测心肌活检组织中柯萨奇B组病毒RNA的临床意义

目的进一步探讨柯萨奇病毒（ＣＶＢ）感染与心肌炎及扩张型心肌病（ＤＣＭ）发病的关系，同时为临床诊断病毒性心肌疾病探求一个快速、敏感和特异的辅助检查方法。方法应用巢式逆转录聚合酶链反应（ｎＲＴ－ＰＣＲ）检测 ２７例心肌活检组织中 ＣＶＢ ＲＮＡ，并以 ９例正常及 １例先心病心肌标本为对照；同时应用间接免疫荧光法检测其中 １０例患者血清 ＣＶＢ１～６ＩｇＭ。结果 １４例心肌炎及 １３例 ＤＣＭ患者中各有５例心肌组织中检测到 ＣＶＢ ＲＮＡ，阳性率分别为３５．７％和３８．５％，而对照组无一阳性（Ｐ＜０．０５）。４例血清ＣＶＢＩｇＭ１～６阳性者，心肌中ＣＶＢ ＲＮＡ均为阴性，而 ６例 ＣＶＢ１～６ ＩｇＭ阴性者中有 ４例心肌组织 ＣＶＢ ＲＮＡ阳性。 结论一部分 ＤＣＭ可能是由病毒性心肌炎后ＣＶＢ持续性感染所致，ｎＲＴ－ＰＣＲ法敏感、特异，非常适合病毒性心肌疾病的临床快速诊断。

荧光定量巢式逆转录PCR(FQ-nRT-PCR)在检测HCV-RNA中的意义

目的:采用荧光定量巢式逆转录聚合酶链反应(FQ-nRT-PCR)检测丙型肝炎患者外周血清HCV-RNA,探讨HCV-RNA的临床应用价值。方法:用FQ-nRT-PCR和酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测192例HCV感染患者血清,比较HCV-RNA和抗-HCV的临床意义。结果:192例丙型肝炎患者血清标本中,HCV-RNA检出率为75.53%(145/192),抗-HCV检出率为91.66%(176/192)。急性丙型肝炎患者HCV-RNA定量均值达5.21×106拷贝/ml,慢性肝炎次之,肝硬化相对偏低,为5.14×103拷贝/ml。结论:192例丙型肝炎患者抗-HCV检出率高于HCV-RNA检出率,但HCV-RNA对丙型肝炎的早期诊断具有灵敏度高、定量准、假阳性率低等优点,此外在病毒复制水平及抗病毒治疗的疗效评估方面具有重要的临床价值。

共存递质囊泡循环动力学研究细胞模型的建立

目的直接证明PC12细胞能够合成和分泌组胺(histamine,HA),为将其应用于交感神经共存递质囊泡循环动力学研究提供实验依据。方法常规培养PC12细胞,用嵌套RT-PCR(nRT-PCR)和Western blot技术检测其合成HA的关键酶组氨酸脱羧酶(histidine decarboxylase,HDC)的mRNA和蛋白表达,利用免疫荧光技术观测HA、HDC以及HA囊泡在细胞中的定位。结果从基因和蛋白水平均证实了该细胞中表达HDC,并利用形态学方法在细胞中检测到HA、HDC以及HA囊泡的存在。结论 PC12细胞确实含有HA,结合分化型PC12细胞与交感神经元相似的特征,可将其作为交感神经共存递质囊泡循环动力学研究的理想细胞模型。

贵州遵义地区蝙蝠脑组织BDV-P24基因片段的检测

目的了解贵州遵义地区蝙蝠博尔纳病病毒(BDV)感染情况。方法采用巢式逆转录聚合酶链反应(nRTPCR)检测82例蝙蝠脑组织BDV-P24基因片段,阳性产物进行基因序列测定、同源性及分子系统树分析。结果在82例蝙蝠脑组织中检测出7例BDV-RNA P24基因片段阳性,只有5例成功测出BDV-P24基因片段,与标准株马源Strain V相比较同源性高达99%,出现2个位点的一致性沉寂突变(nt1650T^C,nt1740G-T,突变率为0.9%),与H1766比较其同源性达97%,出现5个位点的一致性沉寂改变(nt1599A^G,nt1671T^C,nt1677T^C,nt1695G^A,nt1740G^T,突变率为2.2%),与He/80比较起同源性为96%,出现7个位点的一致性沉寂改变(nt1566G^A,nt1581C^T,nt1659T^C,nt1668A^G,nt1674T^C,nt1695G^A,nt1740G^A,突变率为3.1%)。结论贵州遵义绥阳地区蝙蝠存在BDV感染,与马源Strain V存在高度同源性,人感染BDV可能存在潜在的动物源性。

N-乙酰半胱氨酸在肠缺血再灌注肝损伤中保护作用的实验研究

目的 探讨 N-乙酰半胱氨酸 (n- acetylcysteine,NAC)在肠缺血再灌注时对 P-选择素 (P- selectin) m RNA和蛋白表达的影响及肝损伤的保护作用。方法 采用肠系膜上动脉夹闭的方法制作大鼠肠缺血再灌注模型 ,应用逆转录 -聚合酶链反应及免疫组织化学的方法观察肠、肝 P-选择素表达的变化 ,同时检测血、组织中髓过氧化物酶活性及肝功能指标丙氨酸转移酶的活性变化。结果 缺血再灌注 6 0分钟肝组织 Ps- m RNA表达最高 ,免疫组织化学显示其蛋白表达在肠缺血再灌注 6 0 min时增多。再灌注时给予 NAC治疗后肠、肝组织 Ps- m RNA及蛋白为低或不表达。血清丙氨酸转氨酶 (AL T)活性再灌注 30 min升高之后下降 ,再灌注 2 4 0 m in后达最高峰 2 71 .0 0± 2 9.89u/ l(P<0 .0 1 ) ,再灌注时 NAC治疗后明显下降。血清 MPO活性 I4 0 m in/ R30 m in达最高峰 1 4 8.83± 2 2 .80 u/ l(P<0 .0 1 ) ,再灌注时 NAC治疗后也明显下降。结论 NAC可抑制 p-选择素的表达 ,降低中性粒细胞 (PMN)与局部血管内皮细胞粘附、相互作用和激活 。

雌激素对去卵巢大鼠松质骨中骨保护素mRNA表达的影响

目的 :通过去卵巢大鼠予雌激素后 ,腰椎内OPGmRNA的表达进一步探讨雌激素防治骨质疏松的分子机制。方法 :雌性 3月龄SD大鼠 3 6只 ,随机均分为卵巢切除 +雌激素 (倍美力 )预防组 (EP) ,骨质疏松组 (卵巢切除OVX)及正常对照组 (SHAM ) 3组。术后 12周处死大鼠 ,取第 3腰椎椎体 ,异硫氰酸胍一步法提取总RNA ,嵌套式反转录聚合酶链反应 (NRT PCR)扩增待检测各组OPGmRNA的表达。同时取第 4腰椎椎体 ,行骨组织形态计量学检测。结果 12例腰椎骨组织中 ,EP组 10例OPGmRNA呈阳性表达 (阳性率 83 .3 % ) ,OVX组 2例呈阳性表达 (阳性率 16.7% ) ,而SHAM组 12例均呈阳性表达。统计学处理 :EP组与OVX组有高度显著性差异 (P <0 .0 1) ,EP组与SHAM组无显著性差异 (P >0 .0 5 )。骨组织形态计量学检测 ,OVX组骨体积、骨小梁数目均比SHAM组显著减少 ,而骨小梁间隔显著增大。与OVX组比较 ,EP组骨体积、骨小梁厚度增加 ,骨小梁间隔稍有减小 ,无统计学意义。EP对骨小梁数目无明显影响。结论 :雌激素通过增强松质骨中OPGmRNA的表达 ,抑制破骨细胞性骨吸收 ,从而对去卵巢大鼠的骨质疏松有明显的预防作用。

补肾中药对去卵巢大鼠骨组织ER、OPG表达的促进作用

通过检测去卵巢大鼠给予补肾中药后腰椎内ERmRNA及OPGmRNA的表达 ,进一步探讨补肾中药防治骨质疏松的分子机制。将雌性 3月龄SD大鼠 4 8只 ,随机分为卵巢切除 +补肾中药防治 (HDP) ,卵巢切除 +雌激素 (倍美力 )防治 (ER) ,骨质疏松(卵巢切除 ) (OVX)及正常对照组 (SHAM) 4组 ,每组 12只。术后 12周处死大鼠 ,取L3 椎体 ,异硫氰酸胍一步法提取总RNA ,嵌套式反转录聚合酶链反应 (NRT PCR) ,扩增待检测各组ERmRNA及OPGmRNA的表达。同时取L4椎体 ,行骨组织形态计量学检测。结果显示HDP组ERmRNA及OPGmRNA阳性表达率分别为 75 .0 %和 6 6 .7% ;EP组ERmRNA及OPGmRNA阳性表达率均为 83.3% ;OVX组各例ERmRNA均无表达 ,2例OPGmRNA呈弱阳性表达 (阳性率为 16 .7% ) ;SHAM组呈ERmRNA及OPGmRNA阳性表达。χ2 检验 ,HDP组与ER组比较ERmRNA及OPGmRNA阳性表达率均无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;该两组与OVX组比较 ,ERmRNA及OPGmRNA阳性表达率均有高度显著性差异 (P <0 .0 1) ;而与SHAM组比较 ,HDP组ERmRNA ,ER组ERmRNA及OPGmRNA阳性表达率无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ,但HDP组OPGmRNA阳性表达率有显著性差异 (0 .0 1<P <0 .0 5 )。骨组织形态计量学检测 ,OVX组骨体积、骨小梁厚度及骨小梁数目均比SHAM组显著减少 ,而骨小梁?

不明原因的颅内感染与博尔纳病病毒感染的研究

目的分别检测不明原因的颅内感染患者外周血单个核细胞(PBMCs)和脑脊液有核细胞(CSFMCs)中博尔纳病病毒(BDV)p24基因,探讨不明原因颅内感染患者与BDV感染的关系及阳性患者的临床特征。方法用荧光定量巢式逆转录聚合酶链反应(FQ-nRT-PCR)方法检测不明原因颅内感染患者及对照者PBMCs或CSFMCs中BDV p24基因片段,同时用β-肌动蛋白(-βactin)作为内参照,并总结阳性患者的临床特征。结果PBMCs中BDV p24基因片段检测结果显示,实验组7例阳性,对照组均为阴性,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组进行CSF检查的32例颅内感染患者中4例外周血和CSF标本BDV p24基因片段检测均为阳性,阳性基因片段产物测序后与BDV标准病毒株V和马源的BDV病毒株H1766序列比较,结果同源性分别为95.35%和98.84%,在4个位点出现基因突变(nt1649 T→C,nt1656 G→A,nt1670 C→T,nt1676 C→T);7例BDV p24基因片段阳性患者主要以精神行为异常为起病方式,患者与动物关系密切,其他临床特征无特殊。结论贵州省遵义市部分不明原因颅内感染的发生与BDV感染有关,主要以精神行为异常为临床特征。

2015—2017年东北地区PKV流行情况调查及其VP1基因的遗传变异分析

为了解我国东北地区猪嵴病毒(PKV)的流行情况及其VP1基因的遗传进化特征,试验通过巢式RT-PCR法对2015—2017年采集自中国东北地区(黑龙江省、吉林省、辽宁省)的122份样品进行PKV检测,分析PKV感染与腹泻的相关性,并针对PKV VP1基因进行遗传进化分析。结果表明:利用RT-PCR法检测本试验采集的122份样品,扩增PKV 3D基因的PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳,得到的目的片段与预期大小相符。PKV总检出率为88.5%(108/122),其中腹泻样品和健康样品的阳性率分别为87.9%(94/107)和93.3%(14/15)。通过卡方检验分析发现,PKV的感染与腹泻发生不存在统计学相关性(P>0.05)。本试验鉴定的7株PKV的VP1基因核苷酸同源性为80.8%～99.9%,推导氨基酸同源性为86.6%～99.6%。PKV毒株被划分为4个进化分支,本试验鉴定的7株PKV毒株在1,3,4分支均有分布。说明PKV在中国东北地区猪群中有较高的感染率,且其毒株呈现出遗传多样性。

宁夏绵羊脑组织博尔纳病病毒的自然感染状况

目的了解宁夏地区绵羊脑组织博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)的自然感染情况,并分析其与德国马源性标准病毒株He/80的同源性。方法应用荧光定量巢式逆转录PCR(FQ-nRT-PCR)和RT-PCR分别检测宁夏地区163例绵羊脑组织中BDV p24、BDV p40基因片段,并对BDV p24阳性扩增产物进行测序,与国外标准病毒株进行比较。结果 163例绵羊脑组织中6例BDV p24、BDV p40均阳性,阳性率为3.68%(6/163)。测序后经基因序列比对,本实验检测阳性BDV p24片段的核苷酸序列与He/80同源性为100%。结论宁夏地区绵羊脑组织中可能存在动物源性BDV的隐性感染,阳性BDV p24核苷酸序列与He/80具有高度同源性。

MAGE-3基因mRNA的表达在胸腔积液鉴别诊断中的价值

目的研究MAGE-3基因mRNA在胸腔积液中的表达,探讨MAGE-3基因作为良、恶性胸腔积液鉴别诊断指标的价值。方法采用巢式逆转录-聚合酶链反应(nRT-PCR)方法,检测35例患者(25例恶性,10例良性)胸腔积液中MAGE-3的表达情况。结果10例良性胸腔积液组中,均未见有MAGE-3特异性条带;25例恶性胸腔积液组中,有14例可见MAGE-3特异性扩增条带,MAGE-3基因表达阳性率为56.00%,其敏感性、特异性、诊断符合率分别为56.00%、100.00%、68.57%。结论检测胸腔积液中MAGE-3基因mRNA的表达,可以作为鉴别良、恶性胸腔积液的一个指标。

结直肠癌患者外周血CRD-BP RNA表达的探索性研究

目的:本研究通过检测结直肠癌患者外周血中CRD-BP RNA的表达情况,探讨结直肠癌患者外周血中CRD-BP RNA的表达情况与患者临床特性的相关性。方法:应用荧光定量巢式逆转录聚合酶链反应方法检测32例结直肠癌患者和35例对照组人群外周血中CRD-BPRNA的表达。结果:结直肠癌组32个样本中有10个样本检测到CRD-BPRNA表达,阳性表达率为31.25%,对照组35个样本均未检测到CRD-BPRNA表达,两组间差异有统计学意义(P<0.05);实验组中CRD-BPRNA的表达与临床分期及有无淋巴结转移密切相关,各组间比较有统计学意义(P<0.05)。结论:外周血中检测CRD-BPRNA可能会成为结直肠癌的肿瘤标志物并用于诊断;结直肠癌患者外周血中CRD-BPRNA表达可能与临床分期相关。

不明原因的病毒性脑炎PBMCs BDV p24基因片段检测

目的:检测不明原因病毒性脑炎(VE)患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中博尔纳病病毒(Borna Disease Virus,BDV)p24基因,探讨BDV感染的病毒性脑炎患者临床特征.方法:用荧光定量巢式逆转录聚合酶链反应(FQ-n RT-PCR)方法检测病毒性脑炎患者及正常体检者PB-MCs中BDVp24基因片段,同时用β-肌动蛋白(β-actin)作为内参照,总结出临床特征.结果:52例病毒性脑炎PBMCs标本BDV p24基因片段FQ-nRT-PCR检出率13.46%(7/52),拷贝数>102kb/μl.对照组30例正常体检者均为阴性(0%,0/30),经比较两者间阳性率差异有显著性(P<0.05).BDVp24阳性脑炎患者主要以精神行为异常为临床特征.结论:贵州省遵义市部分病毒性脑炎的发生与BDV感染有关,主要以精神行为异常为临床特征.

临床病毒性脑炎标本的博尔纳病病毒核酸检测

目的探讨临床病毒性脑炎（viral eneephalitis，VE）患者与博尔纳病病毒（Borna disease virus，BDV）感染的关系，分析BDV感染的病毒性脑炎患者临床特征。方法用荧光定量巢式逆转录聚合酶链反应（FQ-nRT-PCR）方法检测病毒性脑炎患者及非感染性疾病施行蛛网膜下腔阻滞麻醉的手术患者脑脊液单个核细胞（cembmspinl fluid mononuclear cell，CSFMC）中BDV p24基因片段，同时用β-肌动蛋白（β-actin）作为内参照，脑脊液（CSF）阳性标本基因测序分析并总结出临床特征。结果32例病毒性脑炎脑脊液标本BDVp24基因片段检出率为12．5％（4/32），拷贝数〉10^2/μl。对其中一份CSF阳性标本测序后，与BDV标准病毒株Ⅴ和马源的BDV病毒株H1766序列比较同源性分别为95．35％和98．84％。在4个位点出现基因突变（nt1649 T→C、nt1656 G→A、nt1670 C→T、nt1676 C→T）。该目的基因片段与马源的BDV病毒株亲缘关系最近。阳性脑炎患者主要以精神行为异常为临床特征。结论贵州省遵义市部分病毒性脑炎的发生与BDV感染有关，主要以精神行为异常为临床特征。