基于蛋白质芯片技术筛选与甲型流感病毒NS1蛋白互作的宿主因子及通路分析

目的筛选出与流感病毒Non-structural protein 1(NS1)蛋白结合的人类宿主蛋白并加以分析,确定这些结合蛋白富集的方向及关键蛋白,为抗流感病毒的新药研发提供思路。方法将NS1样本、Biotin样本分别与HuProt^(TM)人类蛋白质组芯片进行杂交孵育,以两重复均满足Z-Score≥3为筛选条件对与NS1蛋白有结合的宿主蛋白进行筛选得到特异性检出蛋白,实验组(NS1蛋白)与对照组(Biotin)比值I Mean_Ratio≥1.4为条件筛选出显著特异性检出蛋白。用检出的195个蛋白进行GO(Biological Process,Molecular Function,Cellular Component)和KEGG_PATHWAY分析,通过蛋白-蛋白相互作用(PPI)及MCODE分析得到关键蛋白。结果获得显著特异性检出蛋白195个,GO分析结果显示这些蛋白主要参与了mRNA加工、RNA结合、蛋白结合,KEGG分析主要富集到RNA降解、氨基酸的生物合成等通路。得到的4个关键蛋白DDX6、HSPD1、PKLR、MTHFD1中DDX6与RNA的合成、翻译等过程相关,而NS1蛋白可以通过调控流感病毒RNA和宿主RNA促进病毒的感染,推测DDX6可能在该过程发挥作用;其他3个蛋白目前虽然没有明确的研究指明其与流感病毒有关系,但是能在其他RNA病毒的感染过程中发挥作用。结论与NS1结合的人类蛋白主要富集到RNA合成、加工、转录等过程中,MCODE分析得到的关键蛋白有潜力成为抗流感病毒新的靶点,但作用机制需要后续实验进行进一步验证。

乙型脑炎病毒NS1′蛋白表达对小鼠毒力的影响

为探究乙型脑炎病毒NS1′蛋白表达对小鼠神经毒力和神经侵袭力的影响,以乙脑病毒疫苗株SA14-14-2为模板,对NS2A基因进行A66G定点突变,并构建全长感染性克隆。体外转录后,将病毒RNA导入BHK21细胞,获得突变病毒SA14-14-2(A66G)。同样以乙脑病毒野毒株SA14为模板,采用相同方法构建并获得突变病毒SA14(G66A)。经测序和间接免疫荧光鉴定,证明突变病毒构建成功。Western blot检测发现疫苗株SA14-14-2和SA14(G66A)不表达NS1′蛋白,而野毒株SA14和SA14-14-2(A66G)能表达NS1′蛋白。生长曲线显示突变病毒的生长特性无明显改变。蚀斑实验发现SA14(G66A)的蚀斑较SA14更小,SA14-14-2(A66G)的蚀斑较SA14-14-2更大。细胞增殖活性实验显示NS1′蛋白表达对BHK21细胞的增殖有明显抑制作用(P<0.01)。疫苗株SA14-14-2与SA14-14-2(A66G)对1周龄小鼠脑内接种的LD50分别为297.9 PFU(0.02 mL)和143.4 PFU(0.02 mL),野毒株SA14和SA14(G66A)对3周龄小鼠脑内接种的LD50分别为0.8 PFU(0.03 mL)和2.3 PFU(0.03 mL)。疫苗株SA14-14-2与SA14-14-2(A66G)对2周龄小鼠腹腔接种的LD50分别为>5.65×10^(6)PFU(0.5 mL)和>1.46×10^(6)PFU(0.5 mL)。野毒株SA14和SA14(G66A)对3周龄小鼠腹腔接种的LD50分别为1.3×10^(3)PFU(0.5 mL)和1.2×10^(4)PFU(0.5 mL)。结果表明,乙脑病毒NS2A中第66位碱基是影响NS1′蛋白表达与否的关键位点,且NS1′蛋白表达能提高病毒对小鼠的神经毒力与神经侵袭力,其中对侵袭力的影响更为显著。

日本脑炎病毒NS1蛋白致脑血管内皮细胞损伤研究

[目的]本试验旨在探究日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)非结构蛋白NS1的生物学功能。[方法]将JEV NS1基因克隆到pFastbac1载体并将其转化至感受态DH10Bac得到重组杆粒,将重组杆粒转染sf9细胞产生重组杆状病毒,通过病毒感染High5细胞成功表达了JEV NS1。在人脑微血管内皮细胞(HBMEC)培养液添加外源NS1蛋白,通过光学显微镜观察细胞形态,利用共聚焦显微镜观察JEV NS1蛋白对HBMEC表面唾液酸修饰的影响,IFA检测细胞中组织蛋白酶L的表达;小鼠经尾静脉注射JEV NS1及其N207糖基化位点突变体蛋白NS1 N207Q,分别于24、48和72 h通过伊文思蓝(EB)染色检测2个蛋白对小鼠的血脑屏障(BBB)通透性的影响。[结果]JEV NS1蛋白通过下调人脑内皮细胞表面的唾液酸修饰和上调组织蛋白酶L表达损伤内皮糖萼;动物试验表明NS1蛋白能够破坏小鼠的血脑屏障;NS1 N207Q蛋白处理对细胞表面唾液酸修饰的影响不显著,体内处理对小鼠的血脑屏障无明显损伤。[结论]JEV NS1蛋白具有损伤人脑微血管内皮细胞的生物学功能,突变N207位点可导致其损伤功能减弱,可为JEV亚单位疫苗候选抗原的优化提供新思路。

鸡细小病毒NS1和VP2蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】原核表达鸡细小病毒(ChPV)的NS1和VP2蛋白,制备其多克隆抗体,为深入探究ChPV蛋白结构功能及建立血清学诊断方法提供物质基础。【方法】通过合成ChPV GX-Ch-PV-21毒株的NS1和VP2蛋白基因序列,构建原核重组表达载体pET-32a-NS1和pET-32a-VP2,将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌transsetta感受态细胞进行原核表达,优化表达条件,以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳和免疫印迹(Western-blotting)方法鉴定NS1和VP2蛋白的表达情况。将表达产物免疫无特定病原体(SPF)鸡获得多克隆抗体,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法测定其效价,以Western-blotting和间接免疫荧光试验(IFA)对多克隆抗体进行鉴定。【结果】SDS-PAGE分析显示,NS1和VP2蛋白条带大小分别约为104和87 kD,与预期条带大小相符。对重组质粒pET-32a-VP2和pET-32a-NS1进行最佳诱导条件筛选,结果显示NS1蛋白表达的最佳诱导条件为异丙基-beta-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)终浓度1.0 mmol/mL,16℃诱导表达过夜;VP2蛋白表达的最佳诱导条件为IPTG终浓度0.8 mmol/mL,20℃诱导表达过夜。可溶性分析显示,NS1和VP2蛋白主要以包涵体形式存在;间接ELISA检测NS1和VP2蛋白的多克隆抗体效价均为1∶10 240 000;Western-blotting鉴定表明,His标签蛋白和相对应的鸡多克隆抗体均能与NS1和VP2蛋白特异性结合;IFA分析显示,VP2和NS1蛋白多克隆抗体均能与ChPV特异性结合。【结论】本研究成功表达ChPV的NS1和VP2蛋白和制备的鸡多克隆抗体,可作为深入探究ChPV蛋白结构功能及建立ChPV血清学诊断方法的基础材料。

鸭坦布苏病毒NS1蛋白的原核表达与多克隆抗体制备

[目的]利用原核表达系统制备鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)NS1蛋白及其多克隆抗体。[方法]利用PCR与核苷酸序列测定方法克隆DTMUV NS1基因,连接至重组表达载体p ET-30a(+),构建重组质粒p ET-NS1,转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,SDS-PAGE和Western blot进行IPTG诱导表达产物分析与鉴定,从IPTG的浓度和诱导时间进行表达条件优化,并进行表达产物可溶性分析,重组DTMUV NS1蛋白经亲和层析纯化后免疫小鼠,制备鼠抗DTMUV NS1蛋白多克隆抗体,并通过间接免疫荧光试验(IFA)鉴定。[结果]成功克隆DTMUV NS1基因,约1065 bp,获得重组质粒p ET-NS1,转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)后,可见分子质量约43 ku的特异蛋白,可以与鸡抗DTMUV多克隆抗体发生免疫反应,终浓度为0.8 mmol/L的IPTG诱导2~5 h为DTMUV NS1蛋白最佳表达条件,呈包涵体形式表达,经亲和层析纯化后,成功获得分子质量约43ku的NS1蛋白,蛋白质量浓度为329μg/m L,鼠抗DTMUV NS1蛋白多克隆抗体可以与DTMUV发生特异性免疫反应。[结论]本研究利用原核表达系统表达和纯化DTMUV NS1蛋白,并制备鼠抗DTMUV NS1蛋白多克隆抗体,可为DTMUV致病机制研究和免疫学检测方法建立提供物质材料与技术指导。

乙型脑炎病毒NS1_(△63)蛋白发酵工艺优化研究

【目的】乙型脑炎病毒NS1蛋白能诱导机体产生保护性免疫,具有开发成亚单位疫苗的潜力。为提高重组蛋白NS1_(△63)的原核表达量,研究进行发酵条件优化以开发稳定高产的蛋白生产工艺。【方法】采用单因素与Plackett-Burman试验对培养基成分进行优化,同时探究诱导条件对发酵的影响,并在5 L发酵罐中进行初步的工艺放大验证。【结果】最佳的培养基成分为乳糖10 g/L、酵母粉19 g/L、蛋白胨25 g/L、磷酸盐37.5 mmol/L、氯化钾1.25 g/L。最佳发酵条件是诱导温度36℃、诱导时间12 h、0.6 mmol/L IPTG、5%接种量。蛋白产量提高到优化前的3.25倍,5 L发酵罐蛋白产量可达3022.23 mg/L。【结论】研究显著提高了NS1△63蛋白的原核产量,为该蛋白应用于亚单位疫苗和检测试剂盒的相关研究奠定了基础。

化学发光免疫分析法快速检测血清登革热病毒NS1抗原方法的建立及初步应用评价

目的建立一种化学发光免疫分析法(chemiluminescence immunoassay,CLIA)用于血清中登革热病毒(dengue virus,DENV)NS1抗原的定量检测。方法先制备NS1单抗与吖啶酯发光剂的偶联物,同时活化磁珠并标记抗NS1的配对单抗,基于双抗体夹心检测方法的技术原理构建定量检测血清中NS1抗原浓度的化学发光检测方法。通过对其灵敏度、特异度和参考区间等试验评估其检测性能。取85例临床确诊的登革热阳性血清样本和20份健康志愿者阴性血清样本,采用美国Cortez公司的登革热NS1快速检测试剂盒和该方法进行临床样本验证。结果该方法对血清中NS1抗原的检测灵敏度为1.12ng/ml,线性范围在0.1~1000ng/ml;与血清中常见干扰物质的交叉反应率均低于2%,检测特异度较好;参考区间的cut off值为3.66ng/ml;对临床样本的检测准确度较高,与Cortez公司NS1检测试剂盒比较无显著性差异(χ^(2)检验P=1.000,一致性检验,Kappa=0.876)。结论建立了一种可定量检测血清中登革热病毒NS1抗原的CLIA法,该方法具有高灵敏度、高准确度、操作简单和方便快捷等优点,有望为登革热临床样品的早期准确筛查提供一种新的选择。

A型流感病毒2009年大流行株NS1蛋白通过诱导宿主细胞自噬促进病毒复制

A型流感病毒属于正黏病毒科、流感病毒属,是分节段、有囊膜、负链RNA病毒。流感可在人群中引起广泛流行甚至大流行,严重威胁人类公共卫生安全。2009年一种新型四源重组流感病毒A/(H1N1)pdm09在世界各地出现并引起21世纪的第一次流感大流行。A/(H1N1)pdm09株具有较高复制能力,传播速度极快,在一个月内即传播至一百多个国家。然而,针对A/(H1N1)pdm09的研究大多是基于临床数据的分子流行病学分析,在病毒的复制机制及与宿主细胞相互作用机制方面存在诸多未知。因此,A/(H1N1)pdm09株区别于其他病毒株引起流感大流行的原因和机制是本领域亟待解决的核心问题。

犬细小病毒CPV-NS1基因的生物信息学分析

试验利用生物信息学方法对犬CPV-NS1基因的开放阅读框、理化性质、亲水性/疏水性、蛋白质二级结构、磷酸化和糖基化位点等进行分析。结果表明,犬CPV-NS1基因编码668个氨基酸,等电点5.77,不稳定指数41.44,为不稳定蛋白;亲疏水平均值-0.540,属于亲水蛋白;二级结构依次为无规则卷曲含286个、延伸链204个、含有α螺旋178个,犬CPV-NS1基因60个潜在的磷酸化位点,4个N-糖基化位点。

H5N1亚型禽流感病毒ns1基因修饰

目的:对H5N1亚型禽流感病毒株(A Qa ST85201)的ns1基因进行修饰并构建ns1基因的真核表达载体。方法:用RT PCR方法扩增A Qa ST85201的ns1基因,之后以扩增产物为模板,采用多重PCR技术对ns1基因进行修饰,将缺失的15个核苷酸片段插入ns1基因中,并将其克隆到真核表达载体,构建pcDNA3.1ns1重组质粒。结果:RT PCR产物测序显示,A Qa ST85201ns1基因开放阅读框全长678bp,编码225个氨基酸。构建的重组质粒经酶切鉴定和序列测定与预期相一致。结论:成功将缺失的15个核苷酸片段引入A Qa ST85201的ns1基因中,重组质粒的构建为NS1蛋白功能研究奠定了基础。

猪细小病毒SY-99株非结构蛋白NS1基因的克隆及序列分析

猪细小病毒 (Porcineparvovirus,PPV)SY_99株由本室分离 ,提取SY_99株的基因组DNA ,利用PCR扩增出全长NS1基因 ,将该基因克隆到原核表达载体pET2 8a中并测序。结果表明 ,NS1基因全长 1989bp ,编码 6 6 2个氨基酸。氨基酸序列中含有在PPV复制过程中发挥重要作用的保守基序GKRN ,并有 3个潜在的糖基化位点 ,分别位于 35 6～ 35 9、4 4 6～ 4 4 9、5 13～ 5 16位氨基酸处。SY_99株NS1基因与其它PPV毒株NADL2_1、NADL2_2、Kresse株核苷酸同源性分别为 98%、99%、99% ,氨基酸同源性分别为 97%、99%、99%。

云南登革4型病毒的鉴定及NS1和NS2a基因序列分析

目的对1989年8月分离自云南省盈江县蚊虫的2株登革病毒进行生物学及分子特征的鉴定,明确这两株病毒的血清型及基因型。方法蚊虫用BHK21细胞和乳鼠法分离病毒,用间接免疫荧光试验、RT-PCR等方法进行鉴定,并对这两株病毒的分子生物学特征进行分析。结果从白纹伊蚊和达勒姆阿蚊中各分离到一株病毒,分别命名为M110和M113,这两株病毒对BHK21细胞能产生明显的细胞病变,脑内接种乳鼠4d左右导致乳鼠死亡。该病毒经血凝、血凝抑制和间接免疫荧光试验提示为黄病毒。分别用黄病毒属特异引物、登革4型病毒NS1和NS2a基因片段特异引物进行RT-PCR扩增、序列测定,证实为登革4型病毒。NS1和NS2a基因序列片段分析表明,M110和M113的NS1核苷酸序列与登革4型病毒基因Ⅰ型的H241株(Y19176)同源性最高,分别为99%、98%;NS2a基因片段与H241的核苷酸序列的同源性分别为96.5%、97.1%。结论从盈江县蚊虫分离到的M110和M113病毒为登革4型病毒基因Ⅰ型,表明云南省西部边境地区在20世纪80年代发生过登革4型病毒的流行。

乙型脑炎病毒NS1基因重组伪狂犬病毒的构建

设计1对引物从含有乙型脑炎病毒NS1基因的质粒pNS1上亚克隆NS1基因,将NS1基因插入到中间转移载体pUSK中,获得重组中间转移质粒pUSK NS1。将pUSK NS1与伪狂犬病毒Ea株TK /gG /LacZ+突变株基因组共转染真核细胞IBRS 2,通过空斑纯化得到了乙型脑炎病毒NS1基因重组伪狂犬病毒株TK /gG /NS1+。经检测,重组病毒能表达具有生物活性的NS1蛋白。该重组病毒可作为猪乙型脑炎和伪狂犬病双价基因工程疫苗用毒株。

乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS1基因片段的克隆、测序与表达

以流行性乙型脑炎病毒减弱毒株SA14 14 2的基因组RNA为模板 ,采用RT PCR技术扩增其 NS1基因的cDNA ,将其克隆到 pMD18 T载体中 ,得到克隆质粒pMD18 T NS1。pMD18 T NS1经 EcoRI和SalI酶切后 ,回收NS 1片段克隆到原核表达载体 pET 2 8a(+) EcoRI/SalI位点 ,构建了重组原核表达质粒 pET 2 8a(+) NS1。转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,IPTG诱导获得高效表达 ,产物经SDS PAGE电泳结果显示 ,表达产物分子量约为 45kD。

猪细小病毒NS1基因的原核表达及重组蛋白的复性

利用PCR技术扩增出PPVNS1基因抗原区。将目的基因与原核表达载体pGEX-4T-1进行连接并转化,重组质粒经鉴定并测序。测序结果表明,目的基因插入的位置、大小和读码框均正确,通过试验摸索并确定了表达NS1基因的最佳诱导条件:IPTG终浓度为1.0mmol/L,诱导时间为10h,温度为37℃,其表达量占全菌蛋白的29.8%。表达产物经SDS-PAGE分析,得到分子量约为52kDa的重组蛋白且以包涵体形式存在。重组蛋白经Westernblot检测,结果证明重组蛋白可被PPV阳性血清识别。用8mol/L尿素变性溶解包涵体,再用稀释方法和还原型、氧化型谷胱甘肽系统相结合的方法对重组蛋白进行复性。ELISA检测表明,复性后的重组蛋白有良好的生物活性。

登革病毒NS1蛋白的原核表达及其在登革热快速诊断中的应用

【目的】重组表达1型登革病毒(DENV-1)和3型登革病毒(DENV-3)NS1蛋白,制备多克隆抗体,建立特异、敏感的登革病毒NS1抗原ELISA检测法。【方法】RT-PCR扩增DENV-1和DENV-3 NS1全长基因,经T-A克隆后,将目的基因分别与质粒PET30a(+)连接构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21感受态细胞。阳性克隆经IPTG诱导表达,并对目的蛋白进行纯化。用纯化的NS1蛋白免疫BALB/c小鼠,制备鼠抗NS1多克隆抗体。应用NS1多克隆抗体建立登革病毒NS1抗原双抗体夹心ELISA检测法。【结果】成功构建了高效表达DENV-1和DENV-3 NS1蛋白的原核表达系统,获得纯化的NS1蛋白;用重组NS1蛋白免疫BALB/c小鼠后获得高效价(>1:30 000)的抗DENV-1和DENV-3 NS1的特异性抗体;用NS1多克隆抗体建立了登革病毒NS1抗原双抗体夹心ELISA检测法,该法可特异性检出登革病毒NS1抗原,敏感性达到1 ng/mL,与黄病毒的其它成员无交叉反应,表明具有良好的特异性。【结论】本研究成功构建了DENV-1和DENV-3 NS1蛋白的原核表达系统,高效表达了具有良好免疫原性及免疫反应性的DENV-1和DENV-3重组NS1蛋白;建立了检测登革病毒NS1抗原的双抗体夹心法,并证明该检测法具有较高的灵敏度和特异性,具有良好的应用前景。

A型禽流感病毒NS1蛋白的表达及其诱导细胞凋亡功能的研究

利用瞬时表达方法表达禽流感病毒(AIV)NS1蛋白,并初步研究了体外表达的NS1蛋白对宿主细胞凋亡的影响。应用脂质体介导法,将含有不同亚型AIV NS1基因的阳性质粒pcDNA3.1(+)-qNS1(H5N1)、pcDNA3.1(+)-rNS1(H9N2)转染Vero细胞系及MDCK细胞系。经SDS-PAGE及Western-blotting检测,qNS1和rNS1基因在Vero细胞及MDCK细胞中均获得了表达。应用AO/EB荧光染色法、Annexin V-PI法分别对转染后的Vero细胞及MDCK细胞进行细胞凋亡检测,结果显示,转染阳性质粒的MDCK细胞凋亡率增高,而转染空载体pcDNA3.1(+)的MDCK细胞及转染的Vero细胞均无明显变化。表明,qNS1、rNS1蛋白在体外培养的MDCK细胞中表达并能够诱导其发生凋亡,而在Vero细胞中却不能发挥此功能。

坦布苏病毒NS1蛋白的表达及ELISA检测方法的建立

为了建立坦布苏病毒(TMUV)感染鸭群的抗体检测方法,以TMUV NS1的原核表达蛋白质作为包被抗原,建立了间接ELISA方法,并对该方法进行了检测条件的优化。将TMUV NS1全基因序列克隆至pET-28a(+),利用BL21(DE3)表达NS1蛋白,纯化后其质量浓度为4.16μg·μL^(-1)。通过方阵试验,确定了NS1蛋白的最佳包被质量浓度是100ng·孔-1,检测血清的最佳稀释倍数为40倍。随后对检测条件进行了优化,优化后的结果:抗原的最佳包被条件是4℃作用过夜;酶标二抗的最佳工作条件是稀释5 000倍,37℃作用1h;阴阳血清的临界值为0.278。一系列试验验证了该检测方法具有很强的特异性、敏感性、重复性。对采集自山东各地的80份血清样品进行检测,其检测结果显示,该方法与经典的鸡胚中和试验检测结果的符合率为93.5%以上,且比传统的中和试验更敏感。对TMUV感染鸭群的血清进行检测,描述了TMUV感染后鸭群抗体水平的消长规律,为该病的防治提供重要的理论依据。以NS1蛋白为包被抗原的间接ELISA方法的建立为临床上TMUV的感染提供了一种新的抗体检测方法,尤其是在TMUV早期感染的检测方面有着更为广泛的应用前景。

检测坦布苏病毒病抗体 NS1-ELISA方法的建立与初步应用

为建立快速检测鸭坦布苏病毒病抗体的血清学方法,本研究利用鹅坦布苏病毒JS804株非结构蛋白NS1基因序列将其克隆至原核表达载体pET32a上,建立重组表达pET32a-NS1,转化至BL21(DE3)中。经IPTG诱导得到NS1融合蛋白,融合蛋白均以包涵体形式存在,包涵体经过变性和复性,纯化的坦布苏病毒NS1蛋白作为包被抗原,在最佳检测条件基础上,建立了检测坦布苏病毒病(Tembusu virus disease,简称TVD)抗体的间接ELISA方法。结果在条件优化后抗原最适包被量为1.925μg·孔-1,抗原最佳包被条件为37℃放置1 h后4℃过夜,血清的最佳稀释度为1∶200,最佳封闭时间为1 h,酶标二抗最适稀释度为1∶1 000,显色时间10 min。阴阳性临界值判定标准为0.346。用建立的间接ELISA方法检测禽流感、新城疫、传染性支气管炎、TVD阳性血清样品均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。板内和板间重复试验的最大变异系数分别为6.7%和8.2%,显示该方法具有很好的稳定性。用间接NS1-ELISA方法对81份疑似鸭坦布苏病毒病血清样品进行检测,有43份样品呈现阳性,E-ELISA有48份呈阳性结果,证明该方法具有较高的敏感性。NS1-ELISA方法的建立为TVB的诊断和流行病学调查提供了一种新的方法。

非结构蛋白NS1-ELISA检测禽流感野毒感染抗体

利用RT-PCR技术扩增获得了H5N2亚型禽流感病毒的NS1基因,ORF长度为678 bp。成功构建了重组表达载体pET-NS1,将其转化BL21(DE3),用终浓度1 mmol／I的IPTG诱导表达5 h,经15％的SDS-PAGE分析表明,诱导表达出了分子量大约为28 KD的 NS1融合蛋白,且以包涵体的形式存在,NS1融合蛋白经His trap Hp Kit柱子纯化或用尿素变性复性,获得纯度较高的NS1蛋白,并以此为抗原,建立了检测抗NS1蛋白抗体的ELISA(NS1-ELISA)方法。最佳包被浓度为2．5μg／ml,血清的最佳稀释倍数为1:200, 酶标二抗的最佳工作稀释度为1:5 000。重组NS1蛋白只与AIV感染的血清反应,而不与ND、IB、IBD、EDS76的阳性血清反应。分别检测H9N2、H5N2和H5N1亚型灭活疫苗和H9N2纯化病毒免疫的血清,各5份,其平均OD490值分别为0．225、0．210、0．205和0．184．均为阴性;而对H9N2和H5N2亚型活毒感染10-15 d的血清进行检测,各5份,其平均OD490值分别为0．610和0．619,均为阳性。因此,NS1蛋白能特异地区分野毒感染和灭活疫苗免疫鸡群,可作为一种鉴别诊断标记,但不能区分亚型．具有A型特异性。NS1-ELISA 方法的初步应用,不仅为生产提供了一种快速、特异、敏感的鉴别诊断方法,为进一步组装成试剂盒奠定了基础,也为禽流感的早期诊断、适时监控和净化提供了行之有效的方法。