鹅细小病毒NS2蛋白间接ELISA方法的建立

为建立检测鹅细小病毒(GPV)的间接ELISA方法,本研究表达了GPV重组NS2蛋白,并以Ni-NTA亲和层析柱纯化的蛋白作为检测抗原,建立间接ELISA检测方法,并进行抗体消长规律的检测。用该方法检测阴性血清样本30份,确定检测临界值为0.281。与琼脂扩散试验结果的阳性符合率为100%,阴性符合率为86.67%。与抗鹅H5、H7、H9亚型禽流感病毒阳性血清和抗鹅副粘病毒阳性血清无交叉反应。在此基础上组装检测试剂盒,试剂盒批内变异系数为4.2%,批间变异系数为8.3%,包被抗原的酶标板在4℃可保存6个月。该方法对人工感染GPV血清检测结果表明,接种病毒后第8周,NS2蛋白的抗体水平达到峰值。本研究为GPV流行病学调查提供了一种快速、方便、敏感的抗体检测方法。

水稻条纹病毒云南分离物NS2蛋白基因的分子变异

通过核苷酸测序表明,我国云南的16个RSV分离物,依据NS2蛋白基因同源性,基本按采样年份(2002、2003)分为了2组。结合已报道的日本T、O分离物,构建系统发育树,分析我国云南分离物与日本分离物可能有共同的起源。

丙型肝炎病毒NS2蛋白在Huh-7细胞中抑制NF-κB活性

将丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS2基因的全长序列插入到真核表达载体pCDNA3.1(-)CMV启动子下游,构建成重组质粒pCNS2.用脂质体LipoVecTM转染Huh-7细胞,转染细胞内可检出NS2的mRNA和蛋白质,表明构建的pCNS2可在Huh-7细胞内成功表达;把不同剂量的pCNS2质粒DNA与报告质粒pNF-κ B-Luc共转染Huh-7细胞,48h后检测荧光素酶活性,结果显示与pCNS2共转染的细胞中pNF-κ B-Luc表达出的荧光素酶的活性比对照细胞降低了约2～4倍,并呈明显的剂量相关性.表明HCV NS2对NF-κ B激活转录活性有明显的抑制作用.这可能与HCV慢性持续性感染的致病性有一定的相关性.

蓝舌病毒NS2蛋白的抗体制备及鉴定

本研究参考GenBank中蓝舌病毒16型(Bluetongue virus serotype 16,BTV-16)标准株RSAvvvv的序列,人工合成编码BTV-16 NS2蛋白的S8基因,将其亚克隆至原核表达载体pPRoEx-HTb中,构建重组表达质粒pPro-NS2,并转化大肠杆菌BL21进行IPTG诱导表达,并进行可溶性分析。SDS-PAGE结果显示,表达的rNS2蛋白主要以包涵体的形式存在于菌体中。利用组氨酸标签纯化树脂获得了高纯度的NS2蛋白,免疫新西兰白兔制备抗NS2蛋白的多克隆抗体。Western blot结果显示,制备的抗NS2蛋白多克隆抗体不仅可与重组表达的rNS2蛋白反应,而且可与BTV感染细胞后的天然NS2蛋白反应。间接免疫荧光结果显示,该抗体也可与BTV感染C6/36细胞中的天然NS2蛋白反应,且发现NS2大量分布于C6/36细胞的胞质中。本研究所制备的NS2蛋白的多克隆抗体具有很好的反应性和特异性,为进一步研究NS2蛋白的功能奠定了基础。

应用酵母双杂交系统筛选与流感病毒NS2蛋白相互作用的宿主蛋白

流感病毒的NS2蛋白能够介导病毒核糖核蛋白复合体(v RNP)的核输出过程,而且可以调控病毒聚合酶的活性,参与禽流感病毒在哺乳动物宿主体内的适应过程。为鉴定与NS2相互作用的宿主蛋白,本研究利用流感病毒NS2蛋白作为"诱饵"蛋白,通过经典酵母双杂交系统筛选与其相互作用的宿主蛋白,并利用免疫共沉淀(Co-IP)和GST pull-down方法进一步验证其相互作用关系。结果表明,通过酵母双杂交系统筛选含有Calu-3、A549、THP-1和U251 4种细胞的c DNA文库,共筛选到7种蛋白,分别为HGS、EXOSC4、ZWINT、PRDX3、IRF3、NDUFB9和RMND5B,根据Gene Ontology分析结果表明,这些蛋白分别参与细胞生长发育、细胞代谢和细胞定位等过程。其中对过氧化物氧还酶3(PRDX3)进行了Co-IP和GST pull-down试验证实重组表达的NS2蛋白和PRDX3蛋白在293T细胞中存在特异性的相互作用。本研究为进一步研究两者之间相互作用如何影响NS2蛋白功能以及病毒的复制周期奠定了基础。

禽流感病毒NS2蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为制备禽流感病毒(AIV)NS2蛋白的多克隆抗体,本研究将人工合成的NS2基因克隆至表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达His-NS2重组蛋白。SDS-PAGE和western blot试验表明,该重组蛋白获得大量表达,可溶性高,并且具有较好的反应原性。将纯化后的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,并通过间接ELISA检测其效价达1∶20 000以上。Western blot和间接免疫荧光试验显示,多克隆抗体能够与NS2蛋白特异性结合。

重组甲型流感病毒NS2蛋白抑制感染小鼠肺组织干扰素的产生

目的用大肠杆菌表达获得甲型流感病毒(IAV)非结构蛋白2(NS2),并观察NS2蛋白对小鼠肺组织γ干扰素(IFN-γ)产生的影响。方法构建p ET22b(+)/NS2原核表达质粒并转化大肠杆菌Rosetta-gami(2),通过诱导表达、纯化获得NS2。将40只BALB/c小鼠,随机分8组,分别为正常对照组、200μg/kg NS2联合病毒组、200μg/kg NS2联合RNA组、100μg/kg灭活病毒、0.2×半数致死量(LD50)病毒组、50μg/kg病毒RNA组、200μg/kg NS2组和100μg/kg NS2组,各组滴鼻给予小鼠处理。通过反转录PCR、Western blot法分别检测肺组织IFN-γ的mRNA和蛋白表达。结果在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下表达并纯化获得重组NS2;将NS2或/和IAV滴鼻给小鼠后,反转录PCR和Western blot法检测表明NS2联合病毒组的小鼠肺组织IFN-γmRNA和蛋白水平较病毒组均降低。结论 NS2抑制IAV所诱导的小鼠肺组织IFN-γmRNA和蛋白的水平。

重组表达丙型肝炎病毒非结构蛋白2(NS2)及其血清抗NS2抗体检测方法的建立与评价

目的重组表达丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白2(NS2),建立并评价基于化学发光法的血清抗NS2抗体的检测方法。方法以HCV 1b基因型的NS2核苷酸序列质粒(PUC-NS2)为模板,构建包含NS2全序列的重组质粒(pGEX-KG-NS2);诱导NS2蛋白原核表达,将纯化后的NS2融合蛋白包被于微孔板,基于化学发光法制备抗NS2抗体检测试剂盒,并对其方法学指标进行评价。结果成功诱导获得相对分子质量(M_(r))约51000的NS2融合蛋白;并制备血清抗NS2抗体检测试剂盒,试剂盒方法学评价:精密度试验(批内变异系数4.60%~9.17%,批间变异系数6.62%~10.09%)结果良好,空白限和检出限的相对发光强度比值(RLIR)分别为1.57、4.80(r=0.9870),分析测量范围(AMR)为1.63~44.50 RLIR;准确度试验:平均回收率为99.4%,类风湿因子等阳性血清标本对本试验无交叉反应,试剂盒15个月内稳定,45例HCV感染者血清抗NS2抗体阳性率为20%(9/45)。结论获得了原核表达的HCV NS2并制备了检测血清抗NS2抗体的试剂盒。

呼吸道合胞病毒NS2蛋白单克隆抗体的制备及初步研究

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是一种引起婴幼儿下呼吸道感染的RNA病毒,其非结构蛋白(Nonstructural protein 2,NS2)在病毒复制和宿主抗病毒免疫中起到关键作用,但目前尚无商品化NS2单克隆抗体。本研究选取NS2基因,经密码子优化后构建重组质粒pET-32a-NS2。将该重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经16℃诱导表达后,对表达蛋白进行SDS-PAGE鉴定。应用亲和层析技术纯化重组蛋白,将纯化的蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体,并将该单克隆抗体用于Western blot分析、免疫荧光检测和免疫沉淀反应。结果表明,诱导后的重组蛋白为可溶性表达,并经纯化后得到高纯度的NS2蛋白;纯化的NS2蛋白免疫小鼠后,获得了一株特异性强、反应性好的RSV NS2单克隆抗体4A4 2B2,其亚型为IgG1,且抗体效价可达1∶1024000;使用该单克隆抗体鉴定出RSV NS2蛋白在转染和感染细胞中正常表达,且NS2主要分布在细胞质中,在细胞核周围形成点状聚集体;在免疫沉淀反应中,该单克隆抗体作为捕获抗体能够特异性结合细胞中表达的NS2蛋白,为NS2蛋白的功能研究奠定了基础。

应用抑制性消减杂交技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白2反式调节基因

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白2(NS2)反式调节基因cDNA消减文库,研究HCVNS2蛋白的反式调节基因。方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术筛选转染pcDNA3.1(-)NS2和空载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞差异性表达基因,并进行生物信息学分析。结果:获得12个差异表达的已知蛋白基因和3个未知功能基因序列,包括:磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican3,GPC3)、酸性核糖体磷蛋白PO、核糖体蛋白L13a、整合素β1、天冬酰胺合成酶、信号肽酶、α2HS糖蛋白、小核糖体蛋白多肽G、蛋白酶样亚单位、黄体酮受体、SDR家族脱氢酶8、Ras家族RAB4A、具有BTB/POZ结构的新蛋白、具有coiled coil helix结构的新蛋白、未知功能基因。结论:成功构建HCVNS2反式调节的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制提供了线索。

黑胸大蠊浓核病毒NS2蛋白的表达、抗体制备及亚细胞定位

ns2是黑胸大蠊浓核病毒的一个非结构基因,所编码的蛋白质大小为30kD,是一个功能未知的基因。为了对该基因进行深入的功能研究,从感染了黑胸大蠊浓核病毒的蟑螂的后肠组织中通过RT-PCR得到ns2基因编码序列,将其构建于原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3)获得融合表达产物。此融合蛋白经分离纯化后,免疫新西兰大白兔,制备其多克隆抗体。采用Western印迹技术,用该抗体检测ns2基因的真核表达产物,证明该抗体有较好的针对NS2蛋白的专一性,可用于对NS2结构和功能的研究。同时,将此编码序列克隆至果蝇细胞表达载体pAC,得到重组质粒后转染果蝇S2细胞表达重组蛋白,通过共聚焦显微镜用该抗体检测该蛋白在S2细胞中的亚细胞定位,发现NS2蛋白主要定位于细胞质,核内仅有少量分布。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS2核酸适配子的筛选

目的获得与丙型肝炎病毒非结构蛋白NS2特异结合的高亲和力的DNA适配子。方法应用配基指数富集的系统进化(SELEX)技术进行HCV-NS2蛋白适配子筛选,将筛选得到的适配子克隆测序,应用DNAMAN软件对适配子一级结构和二级结构进行比对分析。结果重复筛选7轮后,适配子亲和力和特异性都达到最高,克隆测序得到4个适配子序列,命名为A1、A2、A3、A4,其随机序列部分分别为A1:GTGCGTCCCATGCTGCTGACTTAAATGGGTGGAGGGCAG,A2:CGTGAAATTGTTGACCACTCATGGAATCTGATCTCGTTT,A3:GAAAGGGGATAATCACTTAGGCCTCTCGAATAGTTTATC,A4:AGAAAGTTGAGAACTGCTGTTATTTTGTTAACGTACATG。经软件分析,适配子之间没有共同保守序列和同源序列,适配子的二级空间结构以茎环和口袋结构为主。结论获得了能与HCVNS2蛋白高亲和力和特异性结合的DNA适配子。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS2核酸适配子的功能鉴定

目的对丙型肝炎病毒非结构蛋白NS2核酸适配子功能进行鉴定。方法应用ELISA方法检测适配子与HCV-NS2蛋白的亲和力,检测适配子与HCV阳性血清的结合能力和适配子与不同比例稀释的HCV阳性血清的结合能力,并与HCV阴性血清比较。结果筛选得到4条适配子序列A1、A2、A3、A4。4条适配子与HCV-NS2蛋白的亲和力检测吸光度值分别为:A1:0.263、A2:0.515、A3:0.427、A4:0.339,均高于阴性对照吸光度值0.001,差异有统计学意义(P≤0.001);4条适配子均与HCV-NS2蛋白有较高的亲和力,其中,适配子A2与HCV-NS2蛋白的亲和力最高。适配子A2与10人份不同人来源的HCV阳性献血者血清(P1-P10)的结合吸光度分别为0.157、0.145、0.165、0.140、0.241、0.129、0.137、0.222、0.138、0.136,高于其与阴性血清结合吸光度0.006,差异有统计学意义(P≤0.001)。HCV-NS2与1∶0、1∶1、1∶2稀释的HCV阳性血清结合吸光度分别为0.223、0.151、0.093,均高于其与阴性血清结合吸光度0.005,差异有统计学意义(P≤0.001);HCV-NS2适配子与不同比例稀释的HCV阳性血清的结合呈剂量依赖性。结论筛选得到的HCV-NS2适配子功能鉴定表明其具有较强的应用价值。

黑胸大蠊浓核病毒NS2蛋白亚细胞定位

黑胸大蠊浓核病毒（Periplaneta fuliginosa densonucleosis virus,PfDNV）是胡远扬等人在国内首次报道,并在国内外第一个正式分类鉴定的蟑螂浓核病毒[1],ICTV第八次会议正式将其独立列为一个属：Pefudensovirus。