丙型肝炎病毒非结构蛋白2反式调节基因NS2TP的克隆化

目的:克隆化HCV非结构蛋白2(NS2)蛋白反式调节靶基因(NS2TP). 方法:依据我们构建的HCV NS2反式调节基因差异表达的cDNA消减文库筛选结果,利用分子生物学与生物信息学技术获得新基因NS2TP的编码序列,设计特异性引物,并对其进行克隆化研究. 结果:NS2TP基因编码区为456核苷酸(nt),编码产物为151氨基酸残基(aa),经核苷酸序列数据库(GenBank)和蛋白质一级结构序列数据库(SwissProt)同源序列的搜寻,与已知基因序列和蛋白序列之间没有显著同源性,属于未知功能新基因. 结论:发现了HCV

酵母双杂交技术筛选白细胞cDNA文库中新基因NS2TP蛋白结合蛋白基因

目的:筛选HCV非结构蛋白2(NS2)反式调节蛋白(NS2TP)的结合蛋白,探讨HCV的致病机制及新蛋白NS2TP的生物学功能. 方法:应用酵母双杂交系统3,将PCR法扩增的NS2TP 基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒, 转化单倍体酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒pACT2的单倍体酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(C-α-gal)上进行双重筛选,提取阳性酵母茵落的质粒转化大肠杆茵氨苄青霉素-LB平板上选择并测序,结果在GenBank中进行生物信息学分析. 结果:筛选出与NS2TP结合的蛋白基因25个,其中包括细胞色素p450 2E1、核心蛋白聚糖、p68、β2微球蛋白、羧肽酶N2等已知功能基因及3个未知功能序列. 结论:为阐明新蛋白NS2TP的分子生物学功能及HCV 的致病机制提供了新的思路.

NS2TP基因启动子报告基因载体的构建及其活性验证

目的研究丙型肝炎病毒非结构蛋白2反式调节基因(NS2TP)的转录调节机制。方法应用PCR方法扩增NS2TP的启动子,克隆入pGL4.10载体,构建萤虫素酶报告基因载体,转染HepG2细胞,检测双萤虫素酶活性,验证其转录活性;通过缺失突变法构建系列截短的NS2TP基因启动子报告基因载体。结果成功构建了系列截短的NS2TP基因启动子报告基因载体,分别命名为N1、N2、N3和N4,并确定了N3为NS2TP基因的核心启动子。结论构建NS2TP基因启动子的系列截短报告基因载体,确定了其最小转录活性区域,为进一步研究NS2TP基因的转录活性调节机制奠定理论基础。