丙型肝炎病毒NS4A抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定

为探索新型治疗方法 ,制备抗丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS4A的抗独特型人源单链可变区抗体 (抗 IdscFv) ,采用噬菌体表面展示技术 ,将抗HCVNS4A单克隆抗体固相包被于Nunc板 ,应用半合成的人源单链可变区抗体文库技术 ,从噬菌体单链可变区抗体库中经过 5轮“吸附 洗脱 扩增”筛选过程 ,随机挑选 82个克隆 ,利用酶联免疫吸附法 (ELISA)、交叉反应和竞争抑制实验 ,对其进行免疫学检测和鉴定 ,获得与HCVNS4A单克隆抗体结合活性较强的抗 IdscFv阳性克隆 ,并对HCVNS4A特异性抗 IdscFv的编码基因进行序列测定分析。结果 ,经过筛选 82个克隆中有 4 0株克隆ELISA的吸光度 (A4 5 0nm)值较高 ,将这些噬菌体上清与牛血清白蛋白 (BSA)进行交叉反应 ,确定其中有 7株交叉反应较弱 ,结合 2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果 ,最后确定 1株阳性克隆。提取质粒 ,进行DNA序列测定 ,DNA为 789bp。本实验结果提示 ,用噬菌体抗体库技术能够成功地获得抗HCVNS4A的抗 IdscFv,为开展用抗

新基因NS4ATP1的生物信息学分析及在原核细胞中表达

目的对丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4A(NS4A)反式激活靶基因1(NS4ATP1)进行生物信息学分析,并进行原核表达。方法应用生物信息学方法对NS4ATP1基因编码产物进行分析。设计并合成序列特异性引物,聚合酶链反应(PCR)扩增NS4ATP1基因,产物克隆入原核表达载体pET32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),以0.1 mol/L IPTG诱导,SDS-PAGE和West-ern Blot方法检测NS4ATP1在原核细胞中的表达。结果NS4ATP1定位于染色体3q12.2,其氨基酸含有3个N端糖基化位点、8个蛋白激酶C磷酸化位点、9个酪蛋白激酶II磷酸化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点和4个N端酰基化位点。利用pET32a(+)原核表达载体和相应的BL21(DE3)菌株,在体外成功表达了57.0 kDa的NS4ATP1与His标签的融合蛋白。结论生物信息学技术可以全面分析新基因NS4ATP1的染色体定位及潜在的功能位点。新基因NS4ATP1在大肠杆菌中成功表达,为进一步研究其生物学功能提供平台。

丙型肝炎病毒NS4A蛋白在胰腺细胞cDNA文库中的结合蛋白基因的筛选

目的:从人胰腺细胞cDNA文库中筛选出与丙型肝炎病毒(HCV)NS4A蛋白存在相关作用并且参与糖、脂类代谢过程的结合蛋白,为研究HCV影响糖、脂类代谢的分子生物学机制提供实验依据。方法:构建pGBKT7-NS4A作为诱饵质粒,转化酵母菌株AH109,用SD/-Trp筛选阳性菌落。配合两种重组酵母菌株AH109与Y187(人胰腺细胞cDNA文库质粒转化),用四缺培养基及X-α-gal筛选蓝色酵母菌落,提取相应质粒,电转化感受态菌DH5α后再提取质粒,测序仪测序,结果使用PUMED进行序列比对。结果:用pGBKT7-HCVNS4A重组质粒作为诱饵,成功从人胰腺cDNA文库中筛选出5种与HCV NS4A蛋白相结合的蛋白基因,包括CDK5R1、弹性蛋白酶3A、胰脂肪酶、KRAS和胆盐刺激酯酶。结论:HCV NS4A蛋白与胰腺文库中的上述5种代谢相关蛋白存在相互作用,从而影响糖代谢过程。

寨卡病毒NS4A蛋白影响小鼠大脑皮质神经元的迁移

目的在体研究寨卡病毒(Zika virus)NS3和NS4A蛋白对大脑皮质神经元迁移的影响。方法通过c DNA末端快速扩增技术(RACE)及反转录PCR测定Zika病毒SZ01株基因组的开放阅读框,确定NS3和NS4A蛋白编码序列,构建融合Flag标签的p CIG蛋白表达载体。通过子宫内电转技术在E13.5 d小鼠的大脑皮质的神经前体细胞中表达病毒蛋白。免疫组化检测Flag标签、TBR1与e GFP,观察表达NS3和NS4A蛋白的细胞在E18.5 d大脑皮质中的分布,评估Zika病毒蛋白对大脑皮质神经元迁移的影响。结果 1)NS4A的氨基酸序列与NCBI数据库一致,NS3存在1处氨基酸位点突变。2)Flag标签荧光信号与e GFP荧光共定位,提示e GFP可以指示病毒蛋白在皮质中的表达。3)TBR1荧光显示在体表达NS4A后,神经元的分布与p CIG对照组及表达NS3相比有显著差异(P<0.001)。结论在体表达Zika病毒的NS4A蛋白可能影响神经元迁移。

HCV NS3丝氨酸蛋白酶分子间及与其辅助因子NS4A分子间相互作用的研究

丙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓ，ＨＣＶ）非结构蛋白ＮＳ３丝氨酸蛋白酶位于ＮＳ３Ｎ端，对病毒前体蛋白的加工和病毒成熟具有重要作用。目的：用近年来发展起来的检测蛋白分子间相互作用的酵母双杂交系统，证实ＮＳ３分子间及与其辅助因子ＮＳ４Ａ分子间存在相互作用。为进一步建立酵母三杂交系统，用以检测针对ＮＳ３的寡肽小分子对ＮＳ３丝氨酸蛋白酶活性的竞争抑制作用奠定基础；并用计算机系统分析ＮＳ３及ＮＳ４Ａ参与分子间相互作用的可能区段，为抗ＨＣＶ的寡肽小分子药物的研究提供依据。方法：用异硫氰酸胍一步法提取病毒ＲＮＡ，经ＲＴ－ＰＣＲ扩增ＮＳ４Ａ基因片段。目的基因片段双酶切后定向克隆构建双杂交质粒ｐＧＰＴ９－ＮＳ３、ｐＧＡＤ４２４－ＮＳ３和ｐＧＢＴ９－ＮＳ４Ａ，然后转化酵母双杂交系统，分别以Ｘ－ｇａｌ和ＯＮＰＧ为底物对蛋白相互作用作定性和定量检测。蛋白疏水性和二级结构分析采用计算机软件进行。统计学处理采用ｔ检验。结果：ＮＳ３／ＮＳ３及ＮＳ３／ＮＳ４Ａ均出现蓝色反应，表明ＮＳ３／ＮＳ３分子间及ＮＳ３／ＮＳ４Ａ分子间的确存在相互作用，定量分析表明前者相互作用强于后者（Ｐ＜０．０５）。计算机分析结果显示，ＮＳ３参与分子间相?