抗丙肝病毒NS5蛋白单克隆抗体的研制及鉴定

用基因重组的丙肝病毒 ＮＳ５蛋白免疫Ｂａｌ ｂ／ｃ ／小鼠，制备免疫脾Ｂ淋巴细胞，与小鼠骨髓瘤Ｓｐ２／０细胞系融合，筛选获得了１株能分泌抗 ＮＳ５蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该株单克隆抗体为 ＩｇＧ１。ＥＬＩＳＡ及 Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ证实该株单抗对 ＮＳ５蛋白有较好的特异性。

庚型肝炎病毒NS5cDNA片段的表达及其免疫原性的研究

一段长度为 880bp的庚型肝炎病毒cDNA在大肠杆菌BL2 1(DE3)菌株中得到表达。此cDNA被插入到表达质粒 pGEX 5X 1中 ,位于编码日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶 (GST)的DNA序列下游 ,并与GST处于同一阅读框。用乳糖在 37℃下诱导表达出以包涵体形式存在的GST NS5 3融合蛋白 ,并用脲溶法提取了该蛋白 ;在 2 0℃诱导时 ,表达出的蛋白大部分可溶 ,用谷胱甘肽Sepharose 4B亲和层析柱对可溶性的融合蛋白进行了纯化。免疫印迹实验证明 ,此融合蛋白能被庚型肝炎病人的血清和自制的抗GST血清特异性地识别。用PCgene软件对NS5 3氨基酸序列的亲水性和抗原决定簇进行了分析。本研究为庚型肝炎ELISA诊断试剂研制打下了基础。

重组HCV NS5区蛋白抗原在丙型肝炎检测中的应用

对HCVNS5区部分基因进行了克隆表达，获得优质NS5区蛋白抗原。通过对不同人群抗-NS5检测表明，随访3年和6年的输血后丙肝（PT－HC）病例抗一NS5阳性率分别为70．5％和80．0％；随访8年和11年慢性丙肝（C－HC）病例分别为50．7％和82．4％。一般人群阳性率仅为1．7％，正常献血员中未检出阳性。结果表明研制的NS5抗原产生持久、特异性强。16例PT－HC病人抗一NS5和HCVRNA的动态随观察时间延长，阳性率呈升高趋势（P＞0．05）。说明执-NS5抗体和HCVRNA一样可反映病毒活动状态。对11份低值阳性参比血清检测表明．加入重组NSS抗原后，可进一步提高检出率。NSS区抗原的表达成功无疑为研制我国自己的第三代诊断试剂奠定了重要基础。

慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞中HCV RNA和NS_5抗原的检测

目的 研究丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）的情况及其意义。方法 运用非核素原位杂交法（ＮＩＳＨ）和抗生蛋白链菌素－生物素法（ＳＡＢＣ）分别检测２０例慢性丙型肝炎患者ＰＢＭＣ中的ＨＣＶ ＲＮＡ和ＮＳ_５抗原。结果 ２０例患者中有８例（４０％）ＰＢＭＣ中ＨＣＶ ＲＮＡ呈阳性，其中６例（３０％） ＰＢＭＣ中ＮＳ_５抗原同时呈阳性。ＨＣＶ ＲＮＡ主要分布于胞浆中，而ＮＳ_５抗原还可以出现在胞膜上。 ＨＣＶ ＲＮＡ和ＮＳ_５抗原的阳性细胞比例均很低（分别为≤２％和３％。结论 ＨＣＶ可以感染ＰＢＭＣ，感染的主要部位为胞浆。 ＮＩＳＨ法和ＰＣＲ法检测ＰＢＭＣ中ＨＣＶ ＲＮＡ的结果无显著性差异。

抗原决定簇预测在HCV NS5区基因表达研究中的应用

目的：利用生物信息技术，对丙型肝炎病毒ＮＳ５区抗原决定簇进行预测分析，获得具有良好抗原的重组蛋白。方法：以Ｇｏｌｄｋｅｙ程序，通过综合亲水参数、可及性参数、柔韧性参数、抗原性参数、氨基酸序列的电荷分布和β折叠等多种指标，对ＨＣＶＮＳ５区抗原决定簇进行预测分析，克隆并表达部分ＮＳ５区基因。结果：发现７个可能性最大的抗原决定簇肽段，在此基础上表达的ＮＳ５区融合蛋白可与丙型肝炎病人血清发生特异性反应。结论：根据Ｇｏｌｄｋｅｙ程序的预测结果。