牛病毒性腹泻病毒NS5B蛋白的截短表达及多克隆抗体制备

本研究旨在克隆牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的非结构蛋白NS5B截短基因,采用原核表达系统表达获得截短蛋白,并进一步制备其多克隆抗体。构建的原核表达质粒pET-28a-NS5B转化至BL21感受态细胞,经IPTG诱导后,发现NS5B蛋白以包涵体为主。纯化蛋白免疫小鼠制备的多克隆抗体具有良好的反应性,能够特异性识别真核表达的NS5B蛋白。本研究中NS5B蛋白的截短表达及其多克隆抗体的制备为进一步研究NS5B蛋白的生物学功能,以及建立BVDV鉴别诊断的血清学检测方法奠定了基础。

基于丙型肝炎病毒NS5B基因序列分析的基因分型

目的 :建立基于丙型肝炎病毒 (HCV)NS5B基因序列分析的基因分型方法 ,对上海地区慢性丙型肝炎进行基因分型。方法 :用HCVRNA实时荧光定量检测试剂盒对慢性丙型肝炎患者血清标本的HCVRNA水平进行定量分析。用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)和套式 PCR扩增HCVRNA阳性的 4 1份标本的部分HCVNS5B区基因 ,PCR产物经回收、纯化后直接进行测序分析。从GenBank中下载 2 5份不同基因型的HCV原型序列 ,用NS5B区 2 2 2bp的基因片段构建系统进化树 ,对临床标本相应的HCVNS5B区序列进行分析。结果 :基于HCVNS5B基因序列的系统进化树分析 ,可成功地对本组 4 1份标本进行基因分型。分型结果显示 ,1b型占 85 .4 % (35 / 4 1) ,2a型占 12 .2 0 % (5 / 4 1) ,3a型占 2 .4 4 % (1/ 4 1)。结论 :基于HCVNS5B区基因序列的系统进化树分析是一种可靠和方便的HCV基因分型方法。上海地区的HCV基因型以

持续表达HCV NS5B的Bel-7402细胞系的构建与鉴定

HCV NS5B是HCV复制所必需的RNA依赖的RNA聚合酶和抗HCV药物的一个理想靶标,构建持续表达NS5B的肝细胞系将有助于研究HCV在肝细胞的复制机制和抗HCV药物的研发。ScaI酶切含有NS5B基因的重组表达载体pcDNA-5B,获得的线性化pcDNA-5B通过脂质体转染人肝癌细胞系Bel-7402细胞,G418筛选转染细胞。阳性细胞经基因组PCR、RT-PCR和Western Blot鉴定,证实获得持续表达NS5B的Bel-7402细胞系。体外复制试验和荧光素酶试验表明:Bel-7402细胞表达的NS5B蛋白有体外和细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。持续表达有聚合酶活性的HCV NS5B的Bel-7402细胞系的建立为进一步研究NS5B催化的HCV复制机制和NS5B抑制剂的筛选奠定基础。

丙型肝炎病毒NS5B在Hep3B细胞的表达及活性分析

目的丙型肝炎病毒NS5B基因转染人肝癌细胞系Hep3B细胞,检测NS5B的表达与细胞内RNA聚合酶活性。方法使用脂质体把包含全长丙型肝炎病毒NS5B基因的重组载体pcDNA-5B转染到Hep3B细胞。RT-PCR和Wes-tern blot鉴定NS5B基因的表达,荧光素酶检测NS5B的细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。结果RT-PCR和Westernblot发现转染NS5B基因的Hep3B细胞产生NS5B mRNA和NS5B蛋白,荧光素酶分析表明Hep3B细胞表达的NS5B蛋白具有细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。结论人肝癌细胞系Hep3B细胞可以成功表达NS5B基因,且表达的NS5B蛋白具备细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。

HCV NS5b套式PCR在酶切基因分型研究中的应用

目的 :探讨HCVNS5b区酶切分型技术在临床上的应用。方法 :选用了HpaⅡ、Cfr10Ⅰ、AluⅠ、HhaⅠ、HaeⅢ、ApaⅠ、AvaⅡ、TaqⅠ、BstNⅠ、Sau 3AⅠ、StuⅠ、BalⅠ、SmaⅠ等 13种限制性内切酶 ,对已知2 3例 1b型和 17例 2a型样品进行酶切分析和验证。结果 :40例NS5b分型结果表明 2 3例 1b型中有AluⅠ特异切点 ,无 1a的BalⅠ切点和 2b的MboⅠ切点 ,17例 2a型中无A1uⅠ切点和 1a的BalⅠ及 2b的MboⅠ切点。StuⅠ可用于 1b型中基因变异诊断。结论 :HCVNS5b分型结果提示应用该分型技术 ,不仅达到了基因分型效果 ,而且还可检测基因变异 ,证实了我国存在着 1b和

HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶和NS5B RNA聚合酶抑制剂的临床研究进展

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)NS3/4A丝氨酸蛋白酶和NS5B RNA依赖的RNA聚合酶是病毒蛋白前体加工成熟和复制过程中十分重要的两个酶,是抗HCV治疗的理想靶点.近年来,关于HCV NS3/4A蛋白酶和NS5B RNA聚合酶抑制剂的研究是抗HCV研究最为活跃的方向,本文综述了他们在临床试验中的最新研究进展.

人源性抗NS5B单链抗体的制备及鉴定

目的:运用核糖体展示技术制备抗HCV NS5B人源性单链抗体,并进行初步分析。方法:以HCV阳性患者的外周血单个核细胞为材料,扩增全套重链可变区和轻链可变区的基因,构建人单链抗体(scFv)核糖体展示文库;以NS5B蛋白为靶标筛选到scFv基因,并将其连接到pET16b载体并转化至大肠杆菌BL21,诱导表达scFv;对scFv基因测序和特异性分析。结果:成功构建抗HCV scFv库;获得2个具有较强结合活性的scFv;基因分析证实获得预期抗体。结论:成功制备了人源性抗NS5B scFv,为HCV的免疫治疗奠定了基础。

HCV NS5B在人肝癌细胞系Huh7细胞内的表达及活性分析

目的为靶向抗HCV药物筛选奠定基础。方法使用脂质体将包含HCV非结构蛋白5B(NS5B)基因的重组载体pcDNA-5B转染至人肝癌细胞系Huh7细胞,分别采用RT-PCR和Western Blot鉴定NS5B mRNA和蛋白表达,采用荧光素酶试验检测NS5B细胞内RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)活性。结果转染的Huh7细胞出现1.8kb的特异性NS5B mRNA目的带及一条相对分子质量约66 kD的蛋白目的带,且后者具有细胞内RdRp活性。结论人肝癌细胞系Huh7细胞可成功表达具有细胞内RdRp活性的NS5B,以其为靶标的抗HCV药物可为临床治疗提供新思路。

NS5B与HCV负链RNA3′末端特异性结合的分析

NS5B是RNA依赖性RNA聚合酶 ,在病毒RNA合成过程中起到中心催化酶的作用 .在大肠杆菌中表达和提纯了GST NS5B融合蛋白 ,应用紫外交联试验 (UVcross linking)检测NS5B与丙型肝炎病毒 (HCV)负链RNA 3′末端的结合 ,确定NS5B是否参与HCV负链RNA 3′末端复制体的形成 .NS5B可与HCV负链RNA 3′末端发生结合 ,这种结合存在量效关系 ,比与正链RNA 3′UTRX区的结合强约 10倍 ,超大量的非同源性RNA和蛋白质不能竞争抑制NS5B与负链RNA 3′末端的结合 ,证明这种结合存在特异性 .结果提示NS5B是HCV负链RNA 3′末端复制体的成分之一 .

5′端非翻译区和NS5B区在丙型肝炎病毒基因分型中意义的再评价

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)的5′端非翻译区(5′-UTR)和NS5B区对中国人群感染的HCV基因分型的确切意义。方法选择NCBI核苷酸数据库中来源于中国人的HCV全基因组,利用NCBI基因分型工具,对同一条HCV序列中5′-UTR区、NS5B区和全长基因组进行基因分型,确定5′-UTR区和NS5B区在HCV基因分型中的全基因组代表性。在此基础上,选择NS5B区对125例临床HCV-RNA大于1.0E3的标本进行了基因分型。结果与全长基因组的分型结果相比,5′-UTR区基因分型在基因型判断上存在差异,仅有45%的符合率,特别是其无法精确判断基因亚型;而NS5B区基因分型结果与全长基因组的分型结果无论在基因型还是在基因亚型的判断上都具有良好的一致性,符合率可达95%;利用NS5B区对临床125例标本成功进行了基因分型,结果显示以1b和2a两种亚型为主。结论 NS5B区在HCV基因分型中具有良好的全基因组序列的代表性,能够有效用于临床常规的HCV基因分型检测。

湖北地区丙型肝炎患者HCV基因分型及HCV NS5B耐药突变位点分析

目的:检测湖北地区丙型肝炎(丙肝)患者丙肝病毒(HCV)基因分型及HCV NS5B基因耐药突变位点的分布特征。方法:收集自2011-03-2014-05在本院确诊的来自湖北地区的丙肝患者外周静脉血标本273例,采用一代测序法检测每例样本的HCV和NS5B基因序列,将测得的序列与Blast进行在线比对后,统计分析HCV基因型和各亚型检出率,以及HCV NS5B耐药突变位点在HCV各基因亚型中的分布差异。结果:273例丙肝患者共检出1、2、3、6四种基因型和1a、1b、2a、3a、3b、6a六种基因亚型,其中1b亚型检出率较高,占76.19%(208/273),其次是2a亚型,占15.02%(41/273),其它各亚型检出率均不超过4.40%,各亚型检出率差异有统计学意义(P<0.05)。HCV NS5B基因以L159F突变率较高,占17.95%(42/234),与其它位点的基因突变率差异有统计学意义(P<0.05)。同时各个位点的耐药突变发生在2a亚型中的比例较高,达57.26%(134/234),显著高于其它亚型的耐药突变(P<0.05)。结论:分析湖北地区丙肝患者HCV基因分型及HCV NS5B耐药突变位点的分布特点,可为该地区丙肝患者的个体化治疗提供指导依据。

以AdMax载体系统构建携带HCV NS5B基因的重组腺病毒表达载体

目的构建表达丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因NS5B的重组腺病毒表达载体,并对其相关指标进行鉴定,为进一步研究防止丙型肝炎感染的基因免疫和基因治疗奠定实验基础。方法应用基因工程技术将HCVNS5B基因定向克隆至穿梭质粒pDC316上,利用脂质体介导的方法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHGloxΔE1、3Cre和穿梭质粒pDC316-NS5B共转染293细胞,进行同源重组,产生重组腺病毒pAd-NS5B并进行鉴定、反复感染293细胞进行扩增,扩增后测定重组病毒滴度。结果重组病毒颗粒pAd-NS5B经双引物PCR、凝胶电泳证明插入片段与HCV非结构基因NS5B片段大小相符;经测序证明其插入序列与设计HCV NS5B基因序列完全一致,扩增后重组病毒滴度达到2.3×1013IU/L。结论成功构建了表达HCV NS5B基因的重组腺病毒载体。

丙型肝炎病毒NS5B RNA聚合酶抑制剂研究进展

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）是引起慢性肝炎并进而发展为肝硬化和肝细胞癌的主要病原体之一。目前,临床上采用α-干扰素（IFN-α）和利巴韦林（RBV）联合用药治疗丙型肝炎,但有效率仅为40%~50%。寻找HCV特定靶向抗病毒治疗药物是抗HCV研究的重要方向,相应靶点包括NS2和NS3蛋白酶,NS4A、NS4B、NS5A和NS5B,其中以NS5B RNA依赖性RNA聚合酶（NS5B RdRp）为靶标的抗HCV药物研究近年来颇受关注。本文在介绍NS5B及NS5B RdRp结构和功能的基础上,总结归纳以NS5B RdRp为靶点的HCV特定靶向抗病毒治疗药物研究的主要策略,以及近年来相关NS5BRdRp抑制剂的研究进展。

慢性丙型肝炎患者NS5B聚合酶抑制剂耐药位点检测及特点分析

目的针对186例未行抗病毒治疗的慢性丙型肝炎(慢性丙肝)患者进行NS5B聚合酶抑制剂相关的耐药位点检测,同时分析其特点。方法依据NS5B区域的变异位点相关特点,将其分成3段来进行扩增,同时NS5B聚合酶抑制剂相关的耐药位点分析主要采用自行设计的型别特异性引物来进行巣式PCR,产物纯化后直接进行测序鉴定,同时还对患者的临床资料来进行相关分析。定量资料,比如人口学指标、生化指标以及血液学指标、病毒学指标等参数之间的比较主要采用t检验或ANOVA方差进行分析,而组间的非参数比较主要采取Mann Whitney U检验,而分类资料采用χ~2检验。结果核苷类聚合酶抑制剂耐药的变异位点A15G、S96T、S282T主要是在HCV 6a型别中发生,在HCV 1b型别中却并未发现变异位点;对非核苷类的聚合酶抑制剂耐药的变异位点如C316N、S365A主要是在HCV 1b型别中可见,1482L、V499A主要是在HCV 6a以及HCV 2a型别中多见。另外一些新的变异位点A15S、S365P、S365F、S368A以及S368L等位点的变异能否导致耐药性还需进一步研究。结论我国的慢性丙肝患者对于NS5B聚合酶抑制剂确实存在预存的耐药位点,同时变异发生率主要依据HCV基因型而不同,并且不同的基因型号也会存在不同的耐药,这就提示可以在抗病毒药物治疗前进行基因检测。

基于机器学习方法的丙型肝炎病毒聚合酶NS5B非核苷抑制剂的定量构效关系研究

对89个苯并异噻唑和苯并噻嗪类丙型肝炎病毒(HCV)NS5B聚合酶非核苷抑制剂进行了定量构效关系(QSAR)研究.采用遗传算法组合偏最小二乘(GA-PLS)和线性逐步回归分析(LSRA)两种特征选择方法选择最优描述符子集,然后建立多元线性回归和偏最小二乘线性回归模型.并首次尝试使用遗传算法耦合支持向量机方法(GA-SVM)对两种特征选择方法所选的描述符子集分别建立非线性支持向量机回归模型.三种机器学习方法所建模型均得到比较满意的预测效果.采用LSRA所选的6个描述符建立的三个QSAR模型对于测试集的相关系数为0.958-0.962,GA-SVM法给出最好的预测精度(0.962).采用GA-PLS所选的7个描述符建立的三个QSAR模型对于测试集的相关系数为0.918-0.960,偏最小二乘回归模型的结果最好(0.960).本工作提供了一种有效的方法来预测丙型肝炎病毒抑制剂的生物活性,该方法也可以扩展到其他类似的定量构效关系研究领域.

猪瘟病毒非结构蛋白NS3和NS5B多克隆抗体的制备和鉴定

[目的]本试验旨在制备特异性鼠抗猪瘟病毒(CSFV)非结构蛋白NS3和NS5B的多克隆抗体。[方法]根据CSFV NS5B基因序列设计1对特异性引物,以CSFV石门株为模板PCR扩增NS5B基因,同时根据大肠杆菌对密码子的偏嗜性优化了NS3密码子,并将NS3和NS5B基因分别克隆至原核表达载体p Cold I,转化至大肠杆菌Rossetta 2(R2),经0. 1mmol·L-1IPTG诱导后进行融合蛋白的表达和纯化,常规免疫BALB/c小鼠制备抗血清。应用Western blot和间接免疫荧光技术鉴定了多克隆抗体的特异性。[结果]Western blot结果显示,该抗血清不仅能识别原核和真核表达的NS3和NS5B蛋白,也能识别细胞中感染的CSFV并产生特异性条带;间接免疫荧光检测结果表明,2种抗血清除均能与胞浆中的CSFV粒子发生反应外,也能识别宿主细胞中真核表达的NS3和NS5B蛋白。[结论]本试验成功表达了NS3和NS5B,且用其制备的抗血清具有生物学功能,为深入探究猪瘟病毒致病机制奠定了基础。

丙型肝炎病毒NS5B基因的克隆及在大肠杆菌的分泌表达

由于全长丙型肝炎病毒NS5B的疏水性 ,其表达和纯化非常困难。为了分泌表达NS5B ,作者对NS5B进行截短 ,缺失其疏水部分从而在大肠杆菌细胞中分泌表达HCVNS5B基因 ,并测定其活性。用逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)的方法 ,设计截去NS5B疏水部分 ,PCR引物以HCV全长质粒pBRTM/HCV 1为模板 ,克隆到pGEM Teasy载体中 ,双酶切后回收连接到pET 2 1b中表达。大肠杆菌培养上清过柱纯化 ,进行十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和Western免疫印迹分析 ,并用液闪近端分析 (SPA)法分析NS5BRdRp活性。成功地构建了NS5B基因大肠杆菌表达载体 ,Western免疫印迹显示NS5B蛋白在大肠杆菌细胞中表达。表达产物在大肠杆菌培养上清中存在 ,分子量 6 8kD左右 ,而且 [3 H]总掺入率达 6 90 0cpm。NS5B蛋白在大肠杆菌上清中表达成功 ,经过活性测定 。

丙型肝炎病毒NS5B基因在昆虫细胞中的表达

将含有丙型肝炎病毒 (HCV) NS5 B基因的转移载体 p Blue Bac5 B与野生型杆状病毒 (Ac NPV) DNA共转染 Sf9昆虫细胞 ,通过空斑纯化获得带有 NS5 B基因的重组病毒 Ac NS5 B.提取重组病毒基因组 DNA进行Southern分析 ,发现有一条 1.8kb的 DNA片段与标记的探针发生杂交 .Ac NS5 B感染 Sf9细胞后 ,在细胞中表达了分子量为 6 6× 10 3的蛋白 ,用 Western blot方法检查这种蛋白质 ,能与兔抗 HCVNS5

HCV NS5B蛋白表达、纯化及活性测定

以HCV cDNA为模板,设计特异性扩增引物,PCR得到编码NS5B的基因,与PET-21a质粒连接,构建重组质粒。重组质粒转化入大肠杆菌Rosetta菌株,加入IPTG(终浓度0.5 mmol/L),30℃、5 h诱导表达。连续通过Ni-NTA柱、SP阳离子交换柱纯化蛋白,1 L菌液可得到1.2 mg蛋白。体外活性测定结果表明,所得蛋白具有RdRp功能,酶对底物UTP的Km值为2.06μmol/L。