HCVNS5B区序列克隆和重组质粒的构建

选HCV2b基因型的NS5B区序列合成引物，以RT－PCR从慢性丙肝病人血清中扩增一段401bp的cDNA片断作目的基因．插入pTD－T7的多克隆位点．构建了重组质粒pTD－HCV－NS5B。应用ECORI和BamHI双切出克隆HCV基因．酶切片断的分子量与预期相符。用载体序列特异的通用引物进行测序分析证实pTD－HCV－NS5B中克隆基因是HCV2b的NS5B序列．且为正方向插入。

基于丙型肝炎病毒NS5B区的巢式RT-PCR和基因分型的比较研究

目的研究不同引物组合和病毒载量对丙型肝炎病毒（HCV）RNA逆转录和NS5B区巢式PCR反应效率,以及由于逆转录引物不同对基因分型结果的影响。方法用荧光定量PCR检测病毒载量。分别用Oligo（dT）15和随机引物pd（N）6将HCV RNA逆转录合成cDNA,用针对5’-NTR区的巢式PCR进行检测;分别用针对NS5B区的简单引物和简并引物组合进行巢式PCR,比较各组扩增效率。对NS5B区第2轮PCR产物测序并比较基因分型结果的一致性。结果用Oligo（dT）15引物逆转录和随机引物逆转录合成cDNA,5’-NTR区扩增的阳性率分别为87.5%和98.4%,差异有统计学意义（χ2=17.6,P〈0.001）。用HCV1/HCV2-122S/123A简单引物组合和ENO2/ENO4-NS5S3/NS5A5简并引物组合对Oligo（dT）15逆转录cDNA产物进行NS5B区的巢式PCR扩增,阳性率分别为11.5%和35.4%,差异有统计学意义（χ2=30.7,P〈0.001）;用上述两组引物组合对随机引物逆转录cDNA进行NS5B区巢式PCR扩增,其阳性率分别为45.3%和94.3%,差异有统计学意义（χ2=109.1,P〈0.001）。随机引物在不同载量病毒组中的逆转录反应阳性率差异无统计学意义（χ2=2.00,P〉0.05）;随机引物配合简并引物组合在不同载量病毒组NS5B区扩增的阳性率差异无统计学意义（χ2=5.18,P〉0.05）。经Oligo（dT）15引物和随机引物合成cDNA,用简并引物组合对NS5B区进行巢式PCR扩增,通过核酸测序确定HCV基因型完全一致。结论使用pd（N）6随机引物进行逆转录,结合ENO2/ENO4-NS5S3/NS5A5简并引物组合可实现对不同载量HCV的基于NS5B区的高效巢式PCR扩增和基因分型。

2014-2018年广西柳州市HCV的基因型和1b亚型NS5B区的序列特征

目的分析2014―2018年广西柳州市丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)的基因型分布和HCV 1b亚型NS5B区的序列特征。方法收集慢性丙型病毒性肝炎患者血清,提取HCV RNA,反转录后用巢式PCR扩增NS5B区序列,测序后构建进化树分析HCV基因型和基因亲缘关系。用聚类分析法对比HCV 1b本地群、非本地群和参照株NS5B区基因和蛋白序列的差异。结果广西柳州市HCV流行的基因型包括1a、1b、2a/c、3a、3b、6a、6c/d和未分型(NT),分别占3.39%、43.01%、0.42%、13.98%、6.99%、28.81%、3.18%和0.21%;HCV 1b亚型中61.6%的病毒与各参照株进化距离均较远,其比例在2014―2018年分别占HCV 1b亚型的69.8%、78.6%、43.3%、47.6%和59.6%;该群HCV的NS5B基因有15个经常性突变位点,可导致NS5B蛋白I2682V和S2755N发生经常性变异。结论广西柳州市HCV流行的主导基因型依次为1b、6a和3a;HCV 1b亚型中的大部分属于本地亲缘性群,该群HCV的NS5B蛋白存在特征性的变异位点并可能影响直接抗病毒药的作用。

慢性HCV感染者中分离的不同长度3′UTR-PolyU/UC段对IRES介导的翻译及NS5B合成RNA影响

目的 研究丙型肝炎病毒 3′非编码区 (3′UTR)及不同长度PolyU UC段对内在核糖体进入位点 (IRES)介导翻译的影响以及对NS5B聚合酶合成RNA的影响。方法 通过构建含有HCVIRES、荧光素酶 (fireflyluciferase)报道基因和内含不同长度PolyU UC区的 3′UTR序列的系列重组质粒 ,采用体外翻译和细胞转染等方法检测报道基因表达的水平。结果 体外翻译实验和细胞转染实验显示 3′UTR对IRES介导的翻译具有增强作用 ,在体外翻译体系中这种增强作用与PolyU UC区的长度相关 ,而在细胞中则与PolyU UC区的长度无明显相关性 ;3′UTR对共转染的重组NS5B质粒的复制活性具有抑制作用 ,这种抑制作用也与PolyU UC区长度不成正比。结论 HCV 3′UTR与蛋白翻译及RNA合成有关 ,在细胞中并不与PolyU UC区的长度相关。

广州地区丙型肝炎患者HCV基因分型研究

目的研究广州地区丙型肝炎患者HCV基因型分布的变化情况。方法收集207例HCV RAN阳性丙型肝炎患者血清,对其HCV Core区(C区)和NS5B区基因序列进行RT-nPCR扩增,两区扩增成功的PCR产物进行基因测序,测序结果分别与相应的参照株序列比对,构建系统进化树,两区基因分型结果一致者确定HCV基因亚型。结果 185例HCV C区和NS5B区都扩增成功,其中179例两区基因分型结果一致。共检出1、2、3、6型4种基因型和8种基因亚型,其中1b型占40.78%(73/179),6a型占27.37%(49/179),3b型占11.73%(21/179),3a型占8.94%(16/179),2a型占6.15%(11/179),1a型占3.91%(7/179),2b型占0.56%(1/179),6n型占0.56%(1/179)。1b株可分为A、B、C三大簇,A簇与中国广泛流行1b株接近、B簇与中国中部及南部地区流行1b株接近,6a株分为Ⅰ、Ⅱ两大簇,与献血人群及静脉吸毒人群中6a型株接近。结论广州地区丙型肝炎患者HCV基因型以1b、6a、3型为主,存在多种亚型;1b型株包含中国大部分地区的1b型株,6a、3型已取代2a型分别成为第二、三主要流行基因型;未发现6型变异株。