NSP4基因突变的重组牛轮状病毒的拯救及其鉴定

【目的】通过反向遗传技术结合RNAi筛选和蚀斑克隆方法,拯救出毒力减弱的轮状病毒(rotavirus,RV)。【方法】以野生型轮状病毒CHLY基因组RNA为模板,通过重叠PCR方法在NSP4基因93—104 nt引入5个沉默突变核苷酸,并将毒力位点区135aa、136aa和138aa对应的核苷酸进行定向突变,构建了含有突变位点的转录质粒△pT7-NSP4/89/M。将该质粒与携带RNA聚合酶基因的重组质粒pcDNA3.1/T7-RNAP共转染已接种野生型RV病毒的MA104细胞单层,继续培养24 h,获得了携带NSP4变异基因的RV病毒粒子和野生型RV病毒粒子的混合病毒。将获得的混合病毒接种MA104细胞,通过RNA干扰和蚀斑克隆方法逐步筛选纯化以获得拯救RV。【结果】成功拯救出了NSP4基因变异的RV,该病毒在MA104细胞上的病变和致乳鼠腹泻效果较野生型RV明显减弱。【结论】通过反向遗传技术结合RNAi筛选和蚀斑克隆方法成功拯救出毒力减弱的RV;NSP4毒力位点135aa、136aa和138aa的变异对RV毒力改变和腹泻严重程度有影响。

轮状病毒LLR疫苗株非结构蛋白NSP4基因稳定性研究

目的研究轮状病毒(RV)LLR疫苗株NSP4基因的遗传特征及基因稳定性,为疫苗的质量控制提供依据。方法将LLR株轮状病毒毒种LLR38代在原代牛肾细胞上连续传至49代,提取第38、43、44、49代病毒RNA。通过RT-PCR扩增NSP4基因片段,将其克隆入质粒pGEM-T中,进行序列测定与分析。结果 LLR株NSP4基因全长751 bp,含编码175个氨基酸的单一的开放读码框架(ORF)。各代次病毒的NSP4基因核苷酸与推导的氨基酸序列完全一致,与GenBank中LLR参考株(AY219873)进行比较,核苷酸与推导的氨基酸同源性分别为99.1%和99.7%,各关键功能区均未发生改变。与27株A～F不同基因群RV代表株进行比较,LLR株与A基因群RV的NSP4同源性较高,核苷酸推导的氨基酸同源性为89.2%～95.5%;与B、C、D、E、F基因群RV核苷酸推导的氨基酸同源性分别为83.5%～87.5%、85.2%～87.5%、65.9%～67.8%、27.6%～30.8%、77.8%;系统发生树显示LLR株与A基因群RV在一个分支内。结论轮状病毒LLR疫苗株在原代牛肾细胞上连续传代NSP4基因遗传特性极其稳定,从分子水平证明LLR疫苗株毒种及其生产的疫苗是安全的。

宁波地区人轮状病毒NSP4基因特征分析

目的研究宁波地区2005-2006年新生儿感染的A组轮状病毒NSP4基因特征及变异情况。方法利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测新生儿病毒性腹泻便样中的轮状病毒核酸,选择部分阳性样品通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增NSP4全基因并测序,测序结果利用DNAstar和Blast软件进行比较分析。结果在20份新生儿病毒性腹泻便样中共检测到RV阳性样品10份;选择4份阳性样品进行NSP4基因扩增并测序,均能扩增出750bp片段;4个宁波株与标准株Wa、KUN和AU-1的核苷酸同源性分别为93.7%～94.4%、80.5%～81.2%和80.0%～80.8%,与1994-1998年中国其他地区流行株核苷酸和氨基酸的同源性为92.8%～98.9%和93.7%～99.4%。结论在宁波新生儿中有A组轮状病毒的流行,4个宁波株的NSP4基因均为Wa型,RVNSP4蛋白的3个功能区在中国大陆十几年的进化中是高度保守的,宁波株出现了一些特征性的氨基酸变异位点。

猪生殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白nsp4基因的表达及其产物的纯化

根据GenBank中已登录的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)全基因组序列,设计合成了1对特异性引物,对PRRSV非结构蛋白nsp4基因进行了RT-PCR扩增,将回收的目的基因片段克隆到大肠埃希氏菌表达载体pET28a中,构建了重组质粒pET-nsp4,测序结果证实了重组质粒pET-nsp4的可靠性。将pET-nsp4转化至大肠埃希氏菌表达菌株BL21(DE3),用IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果表明,重组菌可表达分子质量约23 ku的蛋白。经镍离子亲和层析柱(Ni-NTA)纯化,获得了高纯度的重组蛋白,Western-blot分析结果表明,nsp4重组蛋白在大肠埃希氏菌系统中获得了正确表达。

猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP4研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起的一种高度接触性传染病。PRRSV编码NSP4具有3C样丝氨酸蛋白酶(3C-like serine proteinase,3CLSP)活性,以保守氨基酸His39-Asp64-Ser118为催化三联体,将pp1a和pp1ab水解成多个非结构蛋白(NSP3~NSP12)。NSP4在调控PRRSV复制、抑制干扰素(interferon,IFN)、早期感染诊断以及诱导细胞凋亡等方面具有重要作用。对NSP4进行综述,为防控PRRS及开发新疫苗提供理论基础。

2007年至2008年昆明地区腹泻患儿轮状病毒非结构蛋白基因特征的分析

目的探讨轮状病毒非结构蛋白(NSP4)基因的特征及变异情况.方法在2007年和2008年昆明医学院第一附属医院儿科住院的96例秋冬季腹泻患儿中,随机选取轮状病毒阳性的12例(其中2007年6例,2008年6例)患儿粪便标本,采用RT-PCR扩增NSP4基因,并进行测序,测序结果用DNAassist软件对核苷酸序列进行翻译,并用Clustal-mp软件与Genbank Datebase中的4株人RV(Wa、KUN、AU-1、Hoch)i、3株动物RV(EW、OSU、SAl)l和中国北京、上海、广州的流行株的NSP4序列进行分析比较.结果 (1)选取的2007年6份和2008年6份样本均可以扩增出NSP4的全长片段,测序表明:2007年6份样本中有5株属于Wa株,1株属于KUN株;2008年6份样本中也有5株属于Wa株,1株属于KUN株.10株Wa株与来自GenBank Database的4株人RV(Wa、KUN、AU-1、Hoch)i和3株动物RV(EW、OSU、SAl)l同源性分别为96.3%、85.3%、84.7%、95.1%和57.7%、92%、82.8%,与中国北京、上海、广州的流行株同源性均在95%以上;2株KUN株与以上来自GenBank Database的标准株的同源性分别为85.3%、98.2%、82.8%、85.9%、60.1%、85.3%、94.3%,和其他地区流行株的同源性为85%左右;(2)以Wa株为参考,10株Wa株的NSP4基因变异发生在第34位氨基酸,第76位氨基酸,第141位氨基酸,第145位氨基酸,第161位氨基酸和第169位氨基酸;以KUN株为参考,2株KUN株的NSP4基因变异仅在第87位氨基酸和第140位氨基酸.结论 2007年和2008年昆明地区流行株NSP4基因为Wa组和KUN组,以Wa组为主.

大熊猫轮状病毒CH-1株NSP4基因的克隆与生物信息学分析

用MA-104细胞增殖大熊猫轮状病毒(RV),并提取总RNA,经RT-PCR扩增,获得NSP4基因,将其克隆到载体进行测序,应用生物信息学方法初步分析NSP4基因的结构及功能,并与不同动物的RV构建系统进化树。结果显示,获得了长750bp的大熊猫RVNSP4基因,此序列包含1个528bp的完整开放阅读框,编码175个氨基酸;预测大熊猫RVNSP4基因的理论分子质量为20223.7u,等电点为6.84,半衰期为30h,不稳定系数为30.40,总平均亲水性为-0.240,疏水性为-2.400～2.622;无信号肽序列;跨膜结构分析表明,NSP4有1个跨膜区,其N端位于病毒膜外区,C端位于病毒膜内区;抗原表位预测显示,NSP4有6个抗原决定簇;结构预测显示,其可能包含2个N-糖基化作用位点、6个蛋白激酶C磷酸化作用位点、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化作用位点和1个酪氨酸激酶磷酸化作用位点;系统进化树分析显示,大熊猫RV NSP4基因与猪RV NSP4基因的进化距离最近。

针对NSP4基因的shRNA抑制牛轮状病毒的体外增殖

本研究根据牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)的NSP4基因序列,设计并构建了shRNA重组慢病毒载体RNAi-H1-89,利用脂质体介导法,将RNAi-H1-89与辅助质粒共转染293细胞,包装shRNA重组慢病毒;重组慢病毒感染MA104细胞24h后继续接种BRV,以针对LacZ基因的shRNA重组慢病毒为对照,48h后与LacZshR-NA对照比较,RNAi-H1-89明显抑制MA104细胞病变;RT-PCR检测结果表明,针对NSP4基因的shRNA可特异性抑制牛轮状病毒NSP4基因表达;病毒滴度测定表明,在转染50%、75%、95%RNAi-H1-89质粒的细胞培养上清液中,病毒滴度分别是对照组的50%、20%和10%。上述实验结果表明,针对NSP4基因的shRNA能高效地沉默NSP4基因,并且能阻断牛轮状病毒增殖。