猪流行性腹泻病毒Nsp6蛋白的分段表达及多克隆抗体制备

猪流行性腹泻病毒(PEDV)的非结构蛋白Nsp6在诱导宿主细胞自噬中起着重要作用。为进一步确定Nsp6蛋白诱导细胞自噬的关键功能域,本研究利用RT-PCR扩增技术获得了Nsp6及其3个分段基因。首先构建了重组原核表达质粒pSUMO-Nsp6,并转化至大肠杆菌Rosetta感受态中,经IPTG诱导并纯化后,所得蛋白用于小鼠免疫,制备抗Nsp6蛋白的多克隆抗体。再将Nsp6及其3个分段基因分别构建至真核表达载体pCMV-HA,并将其转染至IPEC-J2细胞进行真核表达,通过Western blot和双荧光标记法来确定蛋白表达情况。结果:Nsp6蛋白在Rosetta中成功表达,并通过免疫小鼠获得了效价为1∶10240的多克隆抗体,该抗体具有与PEDV和Nsp6蛋白特异性结合的能力;免疫荧光及Western blot结果表明,Nsp-6及其截短基因在IPEC-J2细胞中成功表达,且与制备的Nsp6多克隆抗体发生特异性结合。综上,本研究原核表达了Nsp6蛋白并制备了相应的特异性抗体,验证了Nsp6及其分段基因的在细胞中的真核表达,为进一步研究Nsp6蛋白的特性和功能奠定了基础。

PEDV Nsp6蛋白亚细胞定位及诱导内质网应激的初步研究

Nsp6是PEDV编码的非结构蛋白,目前关于Nsp6蛋白的结构和功能研究尚不清楚。为了更加清晰了解PEDV Nsp6的功能,通过无缝克隆技术、Western blot和间接免疫荧光等方法验证Nsp6蛋白的表达和细胞定位。此外,研究发现Nsp6能与内质网膜关键蛋白PDI共定位,并能引起内质网应激相关蛋白GRP78表达上调。初步证明了Nsp6蛋白能够引起内质网应激反应,为拓展Nsp6蛋白的结构和功能研究提供理论依据。

TB-Chen株轮状病毒NSP5/NSP6及基因型的初步研究

TB-Chen病毒是一株分离自中国胃肠炎患儿的A组轮状病毒。研究结果表明,TB-Chen病毒的NSP5和NSP6由第10基因组节段编码,该节段全长816bp。NSP5含200个氨基酸,由第22~624位核苷酸（nt）编码,预测分子量为21.9 kD,等电点为7.86。NSP6含92个氨基酸,由第80~355位nt编码,预测分子量为11 kD,等电点为9.65。对编码NSP5和NSP6的ORF核苷酸序列的分子进化分析结果表明,A组RV的NSP5至少可分为7个不同的基因型（H1~H7型）,TB-Chen株NSP5属于H2型;NSP6至少可分为8个基因型（h1~h8型）,TB-Chen株NSP6属于h2型。这是首个对A组人RV的NSP6基因分型的研究结果的报道,并且我们建议NSP6的基因型以英文字母＂h＂代表,如TB-Chen株的NSP5/NSP6基因型为H2h2,69M株的NSP5/NSP6基因型为H7h7,Wa株与KU株的NSP5/NSP6基因型为H1h8。

A组轮状病毒NSP6蛋白表达及免疫学性质研究(英文)

轮状病毒(RV)NSP6与NSP5由同一基因片段编码,至今对NSP6性质了解很少。用基因重组表达和免疫学方法,重组表达了A组人RVNSP6蛋白,进行了NSP6的动物免疫及其抗原反应性、免疫原性研究以及RV感染细胞中NSP6的合成及亚细胞分布研究。研究结果表明,NSP6可在原核系统中高效表达,表达蛋白占菌体总蛋白的34.2%;NSP6免疫豚鼠血清抗体可特异性识别菌体细胞中表达的NSP6和SA11及Wa病毒感染的MA104细胞中合成的NSP6蛋白;病毒感染细胞中合成的NSP6在感染后3h就可检测到,12h表达量达到最高;NSP6在病毒感染细胞质中呈弥散状分布,并主要积聚在细胞核的周围,未观察到毒质体样结构。研究结果对深入了解RVNSP6的结构与功能具有重要的意义,具有重要的潜在应用价值。

轮状病毒NSP5和NSP6在感染过程中的作用

轮状病毒（RV）是婴幼儿胃肠道疾病的主要病原体，RV基因组由11个分节段的双链RNA组成，分别编码6个结构蛋白和6个非结构蛋白，其中第11基因片段编码NSP5和NSP6两个非结构蛋白。NSP5蛋白较大，含200个氨基酸，分子量约为21Kd。NSP5在病毒感染细胞中以二聚体形式存在，是一个高度磷酸化的蛋白，可与RV其它非结构蛋白或结构蛋白相互作用，具有RNA结合活性，在病毒复制过程中主要通过与NSP2的一系列相互作用发挥功能。基因11编码的另一个蛋白是NSP6，大多数RV中NSP6由92个氨基酸组成，分子量约为11Kd。并非所有RV毒株都有NSP6编码区，如Mc323和512C毒株。NSP6在病毒感染细胞中表达量很低。目前，关于NSP6的性质，在细胞中的定位以及在病毒复制过程中的作用研究较少。NSP5和NSP6由同一基因片段编码，对它们的结构和功能及其相互间的关系研究还不多。本文对NSP5和NSP6在RV复制过程中的研究作简要综述。