HCVNS5A-B片段的表达及在酶活性研究中的应用

目的利用原核表达载体pBVIL1,表达丙型肝炎病毒非结构蛋白3(NS3)丝氨酸蛋白酶催化底物NS5A-B小分子,为进一步研究蛋白酶活性提供方法学。方法将PCR合成的NS5A-B(2412-2427aa)基因直接插入高效原核表达载体pBVIL1,融合表达NS5A-B片段,包涵体形式的表达产物用8mol/L脲溶解后,采用离子交换和凝胶过滤两步纯化。利用SDS-PAGE、Western blot和ELISA方法,于37℃酶催化条件下,分析NS5A-B底物的降解活性。结果(1)构建了pBVIL1/NS5A-B重组质粒,鉴定证明NS5A-B基因片段正确地插入表达载体上。融合蛋白在转化质粒的HB101菌中得到高效表达。分离纯化重组蛋白后浓度可达0.73g/L。(2)在NS3蛋白酶作用不同时间后,用SDS-PAGE和Western blot证实,底物带可被明显降解,ELISA分析也证明,NS5A-B具有酶底物活性。结论含有酶切位点的NS5A-B融合蛋白可被NS3丝氨酸蛋白酶有效地降解,可用作为NS3蛋白酶的底物,可替代全长NS5A-B和化学合成肽用于酶活性和酶阻断剂的研究。