NYD-SP15基因的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:克隆NYD-SP15基因,构建融合表达载体,在大肠杆菌中表达,并制备抗体。方法:PCR技术扩增NYD-SP15全长开放阅读框,克隆入原核表达载体PET28a,转化大肠杆菌感受态细胞,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后收集菌体蛋白,行SDS-PAGE电泳。将此融合蛋白Ni柱纯化后免疫BALB/C小鼠,Western blotting鉴定。结果:成功地构建了PET28a-NYD-SP15原核表达质粒,并获得了高效表达NYD-SP15的BL21菌株,表达的His标签融合蛋白,分子量为58kDa左右,经免疫小鼠获得了抗NYD-SP15抗体。经Western blotting法分析,抗体为NYD-SP15特异性抗体。结论:构建的NYD-SP15基因的原核表达载体,体外高效表达蛋白,免疫小鼠获得抗NYD-SP15抗体,将为眼部增殖性视网膜病变(PVR)的研究及治疗奠定坚实的基础。

人特异性蛋白激酶-15基因在药物性牙龈增生及正常牙龈组织中表达的研究

目的检测细胞增殖相关基因人特异性蛋白激酶-15(specific protein kinase 15,NYD-SP15)基因在药物性牙龈增生(drug-induced gingival over-growth,DGO)及正常牙龈组织中的表达。方法应用RT-PCR法检测13例药物性牙龈增生患者牙龈切除术中切除的增生牙龈组织标本(A组:钙通道阻滞剂,B组:抗癫痫药物,C组:免疫抑制剂)及20例正常牙龈组织(取自外伤冠折后行牙冠延长术中切除的牙龈组织)中NYD-SP15基因的表达。结果药物性牙龈增生组织中NYD-SP15的mRNA水平高于正常牙龈组织(P<0.05)。在增生牙龈组织中,各药物组间NYD-SP15基因的表达量无统计学差异(P>0.05)。结论 NYD-SP15的异常表达在人药物性牙龈增生发生发展过程中起到一定的作用,但该基因高表达与药物性牙龈增生发生的相关机制尚待进一步研究。

高表达人源SP15对小鼠生长和生殖的影响

目的:探究高表达人源SP15对小鼠生长和生殖的影响,为研究NYD-SP15在生物体中的功能提供动物模型。方法:将人源NYD-SP15 cDNA以及Cre序列插入PCAG启动子下游,构建NYD-SP15转基因表达载体,并通过原核注射,构建全身性表达NYD-SP15的转基因小鼠;将获得的NYD-SP15转基因小鼠与C57/BL6小鼠交配,PCR鉴定转基因小鼠是否有Cre插入,筛选出人源NYD-SP15表达的小鼠,统计转基因小鼠体重变化和后代阳性情况。结果:通过PCR鉴定及公司测序验证,我们成功构建了NYD-SP15转基因过表达载体。并通过PCR鉴定小鼠基因型,筛选出可以表达人NYD-SP15的转基因小鼠。比较转基因小鼠与同窝野生型小鼠体重,发现转基因小鼠体重与同窝野生型小鼠相比无明显区别,说明在体内过表达NYD-SP15对小鼠体重无明显影响。通过对后代阳性小鼠出生情况统计发现F2代阳性小鼠出生率较F1代明显降低。结论:人源NYD-SP15在小鼠体内能正常表达,对其生长无明显影响,但其后代阳性出生率呈逐代下降趋势,推测该原因可能与NYD-SP15在睾丸中表达有关。