新基因NYGGF4在肥胖患儿脂肪组织中的表达验证及生物信息学分析

目的验证新基因NYGGF4在肥胖患儿脂肪组织中的表达,初步探讨NYGGF4的生物信息学特征。方法采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术验证肥胖与健康儿童脂肪组织中NYGGF4基因的表达差异,应用DNA Star、Blast、ProtParam、SOPMA、TargetP、TMHMM、ProtScale、SOSUI、InterproScan和SMART等软件或数据库分析NYGGF4的核苷酸基本特征、蛋白质理化性质、二级结构、信号肽、跨膜结构域、疏水性/亲水性、可溶性、结构域及亚细胞定位等。采用SPSS 11.0软件进行统计学分析。结果NYGGF4基因是一个未知的新基因,差异高表达于肥胖患儿脂肪组织中,生物信息学分析该基因cDNA全长1 527 bp,开放阅读框(ORF)长753 bp,编码250个氨基酸,预测相对分子质量28 271,定位在胞质,蛋白序列分析显示无跨膜螺旋结构,为一非分泌、可溶的亲水性蛋白,蛋白结构域分析提示NYGGF4的N端有一较短的亲脂性靶向序列、C端有一PTB结构域。结论NYGGF4基因是一差异高表达于肥胖患儿脂肪组织中的新基因,可能是胞质内一个信号转导分子,在肥胖的发生发展过程中发挥重要功能,有进一步研究的价值。

NYGGF4基因过表达对脂肪细胞线粒体的影响

目的观察NYGGF4基因过表达对脂肪细胞线粒体的影响。方法构建NYGGF4基因表达载体,转染3T3-L1前体脂肪细胞,G418筛选表达NYGGF4细胞株后,用RT-PCR及western blot技术验证,建立NYGGF4稳定过表达细胞株。用透射电镜观察NYGGF4基因过表达对脂肪细胞线粒体形态的影响,实时荧光定量PCR检测NYGGF4基因过表达及对照空载脂肪细胞中核转录因子PGC1α、NRF1、mtTFA mRNA含量。结果 RT-PCR及western blot均提示NYGGF4稳定过表达细胞株建立成功。NYGGF4基因过表达可以导致脂肪细胞线粒体形态异常,显著上调脂肪细胞PGC1αmRNA表达,对NRF1、mtTFA mRNA水平无明显影响。结论 NYGGF4基因过表达可以导致脂肪细胞线粒体损伤。

NYGGF4小鼠同源基因mRNA在遗传性ob／ob肥胖小鼠体内的表达

目的观察NYGGF4小鼠同源基因在遗传性ob/ob肥胖小鼠(以下简称ob/ob小鼠)与正常C57/BL6J小鼠脂肪组织中的差异表达,分析NYGGF4小鼠同源基因在ob/ob小鼠体内的多组织表达特征,探讨NYGGF4小鼠同源基因与肥胖之间的关系。方法雄性10周龄ob/ob小鼠、正常小鼠(对照组)各12只,以乌拉坦(0.4g/kg)深度麻醉后取腹膜后脂肪、肝、脑、骨骼肌、心肌、结肠、肾、小肠、肺、胸腺、脾等组织,采用RT-PCR技术检测NYGGF4小鼠同源基因的mRNA表达水平,比较NYGGF4小鼠同源基因在ob/ob小鼠与正常对照小鼠腹膜后脂肪组织中的差异表达及在ob/ob小鼠各组织中的表达。结果1.ob/ob小鼠体质量[(38.94±1.97)g]显著高于对照组小鼠[(18.47±0.66)g](P<0.001);2.NYGGF4小鼠同源基因在ob/ob小鼠腹膜后脂肪组织中的表达水平[(89.18±8.31)%]显著高于对照组小鼠[(56.84±9.54)%](P<0.001);3.NYGGF4小鼠同源基因在肝脏、脑、腹膜后脂肪、骨骼肌、心肌、结肠、肾脏等组织中均有表达,从高至低依次为肝脏>脑>腹膜后脂肪>骨骼肌>心肌>结肠>肾脏,虽在小肠、肺、胸腺、脾等组织中未检测到阳性信号,但总体上呈现多组织表达特征。结论NYGGF4小鼠同源基因可能参与肥胖发生的病理生理机制,并在肝脏、脑、腹膜后脂肪、骨骼肌等胰岛素作用的靶组织中表达水平相对较高。

Leptin对人成熟脂肪细胞中NYGGF4基因表达的调控

目的:观察leptin对人成熟脂肪细胞中NYGGF4基因表达的调节作用。方法:体外培养人前体脂肪细胞,在诱导人前体脂肪细胞分化成熟的基础上,应用100ng/ml人重组leptin分别干预成熟脂肪细胞6、24h,采用实时荧光定量RT-PCR技术检测成熟脂肪细胞中NYGGF4基因mRNA的表达水平。结果:100ng/ml leptin干预人成熟脂肪细胞6h后,NYGGF4基因mRNA的相对表达量为0.000476±0.000178,显著低于对照组0.00114±0.000275,P<0.05;干预24h NYGGF4基因mRNA的相对表达量为0.000835±0.000211,也显著低于对照组0.001419±0.000193,P<0.05。结论:leptin能显著下调成熟脂肪细胞中NYGGF4基因的表达。

人脂肪组织NYGGF4基因表达的调控研究

目的探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)对肥胖基因NYGGF4表达的调控作用。方法取适量大网膜脂肪组织进行体外培养,分别以10 ng/ml TNF-α和20 ng/ml IL-6干预6、12、24、48、72 h,应用荧光定量RT-PCR技术检测NYGGF4 mRNA表达水平的变化。结果 (1)TNF-α对人脂肪组织NYGGF4 mRNA表达具有明显的上调作用,且具有明显的时间依赖性,呈现随作用时间延长,效应逐渐增加的趋势。(2)IL-6具有降低人脂肪组织NYGGF4 mRNA表达的作用,但起效较慢,IL-6作用时间与脂肪组织NYGGF4 mRNA水平呈明显负相关关系。结论炎性细胞因子TNF-α、IL-6对人脂肪组织NYGGF4基因的表达呈现不同模式的调控作用,TNF-α可以促进人脂肪组织NYGGF4基因表达,而IL-6对NYGGF4的表达则具有抑制作用。

NYGGF4基因过表达对成熟脂肪细胞线粒体形态及动力学的影响

目的探讨NYGGF4基因过表达对成熟3T3-L1脂肪细胞线粒体形态及动力学的影响。方法以3T3-L1前体脂肪细胞为载体,建立NYGGF4基因稳定过表达细胞株,以空载质粒转染的细胞为对照,将前体脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞。采用透射电镜观察成熟脂肪细胞的线粒体形态,采用荧光定量PCR技术检测成熟脂肪细胞中线粒体融合基因(Mfn)1 mRNA、Mfn2 mRNA、线粒体动态相关基因(Drp)1 mRNA的表达水平。采用Western blot方法检测Mfn1蛋白、Mfn2蛋白、Drp1蛋白的表达水平。结果 1.电镜观察发现NYGGF4基因过表达的成熟脂肪细胞线粒体体积变小、数量明显减少,线粒体嵴断裂、减少、消失,部分线粒体肿胀,甚至呈空泡状;对照组成熟脂肪细胞的线粒体形态基本正常,线粒体嵴清晰可见,线粒体无明显肿胀、皱缩。2.NYGGF4基因过表达成熟脂肪细胞Mfn1 mRNA及Mfn1蛋白表达水平均显著高于对照组。3.NYGGF4基因过表达成熟脂肪细胞的Mfn2 mRNA、Drp1mRNA及相应蛋白表达水平与对照组比较差异均无统计学意义。结论在3T3-L1成熟脂肪细胞中,NYGGF4基因过表达可导致线粒体形态发生变化、数量减少,同时上调Mfn1 mRNA和Mfn1蛋白表达水平,提示NYGGF4基因在成熟脂肪细胞中过表达能影响细胞线粒体形态及动力学。

NYGGF4基因致胰岛素抵抗的线粒体解耦联机制

目的探讨线粒体解耦联机制在NYGGF4基因致胰岛素抵抗(IR)中的作用。方法以3T3-L1前体脂肪细胞为工具,建立NYGGF4基因稳定过表达细胞株,以空载质粒转染的细胞为对照,将前体脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞,采用液闪仪检测成熟脂肪细胞对[3H]-2-脱氧葡萄糖的摄取率,采用荧光定量反转录-PCR技术检测成熟脂肪细胞中解耦联蛋白(UCP)2 mRNA、UCP4mRNA表达。采用线粒体特异性染料MitoTracker Red预染成熟脂肪细胞,激光共聚焦显微镜下观察线粒体膜电位,进一步应用流式细胞仪对荧光强度进行定量分析。结果 1.NYGGF4基因过表达脂肪细胞胰岛素刺激状态下的葡萄糖摄取率显著低于对照空载脂肪细胞,NYGGF4基因可显著降低成熟脂肪细胞胰岛素刺激下的葡萄糖摄取率;2.NYGGF4过表达脂肪细胞线粒体UCP2 mRNA、UCP4 mRNA表达显著高于对照空载脂肪细胞;3.NYGGF4过表达脂肪细胞线粒体膜电位低于空载脂肪细胞,但定量分析差异无统计学意义。结论 NYGGF4基因可以上调脂肪细胞线粒体UCP2 mRNA、UCP4 mRNA表达,线粒体解耦联异常可能参与NYGGF4致脂肪细胞线粒体功能障碍及IR的机制。

NYGGF4(PID1)基因过表达对脂肪细胞中脂肪酸合成酶表达的影响

目的研究NYGGF4(PID1)基因过表达对脂肪细胞中脂肪酸合成酶(FASN)的影响。方法体外培养稳定转染NYGGF4(PID1)基因的3T3-L1前体脂肪细胞株[NYGGF4-pcDNA3.1(+)/myc-His B,A组]及空载体对照细胞株[pcDNA3.1(+)/myc-His B,C组],经1-甲基-3异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素方案诱导分化为成熟脂肪细胞后,采用RT-PCR和Western blot法检测FASN基因mRNA和蛋白表达水平。结果与C组相比,A组成熟脂肪细胞FASN mRNA及蛋白表达水平均明显增高(P<0.05)。结论 NYGGF4(PID1)基因过表达可能影响成熟脂肪细胞中脂肪酸的合成。

NYGGF4基因在人前体脂肪细胞分化过程中的表达及肿瘤坏死因子α对其调控的研究

目的观察人前体脂肪细胞诱导分化过程中NYGGF4基因mRNA表达水平的变化，探讨重组肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNFα）对成熟脂肪细胞中NYGGF4基因表达水平的调节作用。方法体外培养人内脏来源的原代前体脂肪细胞（human preadipocytes—visceral，HPA—v），在诱导HPA-v分化成熟的基础上，应用不同浓度重组TNFα干预成熟脂肪细胞16h，或以10ng／mL TNFα分别干预不同时间，采用实时荧光定量逆转录PCR技术检测的NYGGF4 mRNA表达水平。结果（1）HPA—v诱导分化至第17d，具备成熟脂肪细胞特征；（2）NYGGF4基因低表达于人前体脂肪细胞中，随脂肪细胞分化成熟其表达水平逐渐升高；（3）随TNFα干预浓度增高及干预时间延长，人成熟脂肪细胞中NYGGF4 mRNA水平呈现逐渐升高的趋势。结论NYGGF4基因具随脂肪细胞分化成熟表达逐渐上调的特征，TNFα能显著上调成熟脂肪细胞中NYGGF4基因的表达，其效应具有剂量依赖和时间反应性。

肥胖相关新基因NYGGF4的系列研究

本研究小组前期以抑制性差减杂交技术筛选肥胖与健康人腹膜后脂肪组织中的差异表达基因,结果发现一条新基因在肥胖患儿脂肪组织中表达量明显升高,将其命名为NYGGF4。2006年以来本研究小组致力于该基因的功能研究,系统、全面地研究了该基因的生物学特性及功能,基因表达、调控的特点,现将这些系列研究进展作一综述。

人脂肪组织中NYGGF4基因转录本检测

目的:探讨肥胖相关新基因NYGGF4在人脂肪组织中转录本的大小及是否存在剪切异构体。方法:采用Northern blot技术检测NYGGF4基因在人脂肪组织中的表达情况。结果:检测到一条大小1.5kb左右的条带,与数据库中NYGGF4 mRNA长度一致,未检测到其他转录本。结论:NYGGF4基因在人脂肪组织中的转录本大小约为1.5kb,并不存在剪切异构体。

NYGGF4基因表达沉默对3T3-L1脂肪细胞线粒体代谢的影响

目的探讨NYGGF4(又称PID1)基因沉默对脂肪细胞线粒体代谢的影响。方法以3T3-L1前体脂肪细胞为研究对象,体外培养稳定转染NYGGF4基因沉默载体(pGPU6/GFP/Neo-shRNA,NYGGF4-RNAi)的3T3-L1前体脂肪细胞,以转染空载体(pG-PU6/GFP/Neo-shRNA,NC shRNA)的3T3-L1前体脂肪细胞作为对照,经1-甲基-3异丁基黄嘌呤加地塞米松、胰岛素方案诱导分化为成熟脂肪细胞,采用实时定量RCR技术检测成熟脂肪细胞中线粒体代谢酶指标:己糖激酶、乙酰辅酶A羧化酶柠檬酸合成酶、肉毒碱棕榈酰转移酶1、细胞色素C基因表达水平。结果 NYGGF4表达沉默与NYGGF4基因过表达相比,可以部分逆转3T3-L1脂肪细胞中己糖激酶、乙酰辅酶A羧化酶、柠檬酸合成酶、肉毒碱棕榈酰转移酶1、细胞色素C基因表达水平,差异均有统计学意义。结论NYGGF4基因过表达,下调3T3-L1脂肪细胞中定位于线粒体的代谢关键酶,提示NYGGF4基因的动态平衡对维持3T3-L1脂肪细胞的线粒体代谢具有重要作用。

NYGGF4(PID1)基因过表达对脂肪细胞线粒体代谢的影响

【目的】观察NYGGF4(PID1)基因过表达对脂肪细胞线粒体代谢的影响。【方法】以3T3-L1前体脂肪细胞为研究对象,体外培养稳定转染NYGGF4(PID1)基因(NYGGF4-pcDNA3.1(+)/myc-His B)的3T3-L1前体脂肪细胞,以转染空载体[pcDNA3.1(+)/myc-His B]的3T3-L1前体脂肪细胞为对照,经1-甲基-3异丁基黄嘌呤(MIX)加地塞米松、胰岛素方案诱导分化为成熟脂肪细胞,采用Real-time PCR检测线粒体代谢酶指标:己糖激酶(Hexokinase,HKI)、乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA,ACC)、柠檬酸合成酶(citrate synthase,CS)、肉毒碱棕榈酰转移酶1(Carnitine palmitoyl-transferase 1,CPT1)、细胞色素C(Cytochrome c,Cyc-c)基因表达水平。【结果】NYGGF4(PID1)过表达显著降低3T3-L1脂肪细胞己糖激酶、乙酰辅酶A羧化酶、柠檬酸合成酶、肉毒碱棕榈酰转移酶1、细胞色素C基因表达水平,差异有统计学意义。【结论】NYGGF4(PID1)基因过表达,下调3T3-L1脂肪细胞中定位于线粒体的代谢关键酶,提示NYGGF4(PID1)基因过表达能影响3T3-L1脂肪细胞的线粒体代谢。

游离脂肪酸、白细胞介素-6对人成熟脂肪细胞中NYGGF4基因表达的调控

目的观察游离脂肪酸(FFA)、IL-6对人成熟脂肪细胞中NYGGF4基因表达水平的调节作用。方法体外培养人前体脂肪细胞,采用1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(MIX)、胰岛素、地塞米松、罗格列酮方案诱导人前体脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞,以1mmol/L混合FFA(油酸、亚油酸、月桂酸、肉豆蔻酸和花生四烯酸)、30μg/L人重组IL-6干预成熟脂肪细胞6、24h,均设未干预细胞为对照,采用实时荧光定量RT-PCR技术检测干预后成熟脂肪细胞中的NYGGF4基因mRNA表达水平。结果1mmol/L混合FFA干预人成熟脂肪细胞6h,NYGGF4基因mRNA相对表达量为0.00151±0.00024,与对照组(0.00114±0.00028)比较无显著性差异,干预时间延长至24h,NYGGF4基因mRNA相对表达量为0.00191±0.00019,显著高于对照组(0.00142±0.00019)(P<0.01);30μg/LIL-6干预人成熟脂肪细胞6hNYGGF4基因mRNA相对表达量为0.00058±0.00031,显著低于对照组(0.00114±0.00028)(P<0.05),干预24h,NYGGF4基因mRNA相对表达量为0.00123±0.00019,与对照组(0.00142±0.00019)比较无显著性差异。结论FFA可显著上调人成熟脂肪细胞中NYGGF4基因的表达,IL-6对人成熟脂肪细胞中NYGGF4基因表达具有一过性下调作用。

TNF-α对3T3-L1成熟脂肪细胞中NYGGF4小鼠同源基因表达的影响

【目的】观察TNF-α对3T3-L1成熟脂肪细胞中NYGGF4小鼠同源基因表达水平以及胰岛素刺激下的葡萄糖摄取率的影响。【方法】体外培养3T3-L1前体脂肪细胞,诱导分化为成熟脂肪细胞后,应用不同浓度（10、25、50 ng/mL）重组TNF-α干预成熟脂肪细胞16 h,或以10 ng/mL重组TNF-α分别干预24、487、2 h,采用实时荧光定量RT-PCR技术检测TNF-α干预后3T3-L1脂肪细胞中NYGGF4小鼠同源基因mRNA表达水平;另外,采用[3H]-2-脱氧葡萄糖掺入法检测TNF-α干预24、48、72h后成熟脂肪细胞葡萄糖摄取率。【结果】1）不同浓度TNF-α均能显著上调3T3-L1成熟脂肪细胞中NYGGF4小鼠同源基因表达（P均〈0.001）,在0～25 ng/mL浓度范围内呈现浓度依赖性,随TNF-α干预浓度增高,NYGGF4小鼠同源基因的表达水平逐渐升高;2）TNF-α对3T3-L1成熟脂肪细胞中NYGGF4小鼠同源基因的表达调节具时间反应性,呈现随干预时间延长该基因表达逐渐上调的特征,10 ng/mL TNF-α干预人成熟脂肪细胞24 hNYGGF4小鼠同源基因mRNA表达水平即显著上调（P〈0.001）;3）TNF-α干预48 h,3T3-L1成熟脂肪细胞胰岛素刺激的葡萄糖摄取率与未干预组比较下降50%以上,干预72 h,胰岛素刺激的葡萄糖摄取受到进一步抑制。【结论】TNF-α可以上调3T3-L1成熟脂肪细胞中NYGGF4小鼠同源基因的表达,抑制3T3-L1成熟脂肪细胞胰岛素刺激下的葡萄糖摄取。

NYGGF4基因表达沉默对3T3-L1脂肪细胞线粒体动力学的影响

目的探讨NYGGF4基因表达沉默对3T3-L1成熟脂肪细胞线粒体动力学的影响。方法以3T3-L1前体脂肪细胞为工具,分别构建NYGGF4基因表达沉默细胞株和空载对照细胞株,通过地塞米松(DEX)、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(MIX)、胰岛素联合方案将前体脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞。采用实时荧光定量PCR检测成熟脂肪细胞中线粒体融合基因(Mfn)1/2、线粒体动态相关基因(Drp)1、线粒体分裂基因(Fis)1的mRNA表达水平和线粒体DNA(mtDNA)拷贝数。结果 NYGGF4基因表达沉默成熟脂肪细胞的Mfn1/2、Drp1表达水平与对照组相仿。NYGGF4基因表达沉默成熟脂肪细胞的Fis1的表达水平显著高于对照组(P<0.05)。结论在3T3-L1脂肪细胞中,NYGGF4基因表达沉默可显著上调Fis1基因的表达水平,提示NYGGF4基因表达沉默可能通过影响线粒体分裂从而影响成熟脂肪细胞线粒体动力学。

运动对高脂饮食性肥胖大鼠脂肪细胞线粒体形态和动力学的影响机制

目的:研究有氧运动对高脂饮食性肥胖大鼠脂肪细胞线粒体形态和动力学的影响,并对其可能的机制进行探讨。方法:将三周龄SD健康雄性大鼠随机分为正常组和高脂饮食组,后者在第8周时选取体重超出正常对照组平均体重20%的大鼠为肥胖大鼠,再分为肥胖对照组、运动干预组,第16周时处死。采用透射电镜观察脂肪细胞的线粒体形态,采用荧光定量PCR技术检测脂肪细胞中NYGGF4基因的表达水平,采用Western blot方法检测Mfn1蛋白、Mfn2蛋白、Drp1蛋白的表达水平。结果:1)肥胖组大鼠脂肪细胞线粒体体积变小、数量明显减少,线粒体嵴断裂、减少、消失,部分线粒体肿胀,甚至呈空泡状;有氧运动干预组大鼠脂肪细胞线粒体形态基本正常,与正常组接近,表现为线粒体嵴清晰可见,线粒体无明显肿胀、皱缩。2)肥胖组大鼠脂肪细胞NYGGF4mRNA、Mfn1/2蛋白表达水平均显著高于对照组,Drp1蛋白表达水平显著低于对照组;有氧运动干预组大鼠较肥胖对照组大鼠脂肪细胞NYGGF4mRNA、Mfn1/2蛋白表达水平显著降低,Drp1蛋白表达水平显著升高,差异具有非常显著性;与正常对照组相比差异无统计学意义。结论:有氧运动可使肥胖大鼠脂肪细胞线粒体的形态、分布、数量维持适宜的动态平衡,预防线粒体遭受过多损伤;有氧运动可能通过调节NYGGF4mRNA表达水平部分影响线粒体形态及动力学。初步揭示了有氧运动干预脂肪细胞线粒体形态和动力学异常在健康减脂中的作用,从新的视角为有氧运动的减肥作用提供了理论依据。